2023年7月17日重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究團(tuán)隊(duì)在Nature子刊neuroscience bulletin發(fā)表論文“CXCR5 Regulates Neuronal Polarity Development and Migration in the Embryonic Stage via F?Actin Homeostasis and Results in Epilepsy?Related Behavior”，揭示了CXCR5通過F-肌動蛋白穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)胚胎期神經(jīng)元極性的發(fā)育和遷移，并導(dǎo)致癲癇相關(guān)行為。
癲癇是一種常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，與神經(jīng)發(fā)育和免疫功能受損有關(guān)。趨化因子受體CXCR5通過一種未知的機(jī)制參與癲癇發(fā)作。該研究中作者確定了CXCR5基因在小鼠大腦的不同發(fā)育階段和癲癇患者的腦組織中的表達(dá)模式和分布。隨后發(fā)現(xiàn)CXCR5的敲低增加了小鼠對戊四唑和紅藻酸誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作的易感性，而過表達(dá)CXCR5的小鼠則有相反的效果。通過病毒敲低CXCR5，負(fù)向注入了遷移神經(jīng)元的運(yùn)動性和多極向雙極的轉(zhuǎn)變。利用人來源誘導(dǎo)的體外多潛能干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)育模型，作者確定CXCR5通過在神經(jīng)發(fā)育的不同階段穩(wěn)定肌動蛋白的細(xì)胞骨架來調(diào)節(jié)神經(jīng)元的遷移和極化。電生理實(shí)驗(yàn)表明，CXCR5的敲低誘導(dǎo)神經(jīng)元過度興奮，導(dǎo)致癲癇發(fā)作次數(shù)增加。結(jié)果表明，CXCR5的防御性通過一種先前未知的機(jī)制，即神經(jīng)元極性的破壞，觸發(fā)了與癲癇發(fā)作性相關(guān)的電活動。
圖一 CXCR5在小鼠和癲癇組織中的定位和表達(dá)
作者首先觀察了CXCR5在不同發(fā)育階段小鼠中的分布。在E19和P7，發(fā)現(xiàn)CXCR5在小鼠海馬和皮質(zhì)中與MAP2共同標(biāo)記；其次，通過免疫熒光定量分析發(fā)現(xiàn)CXCR5在癲癇患者的皮層中表達(dá)增加，而在紅藻氨酸（KA）誘導(dǎo)的癲癇小鼠的海馬中表達(dá)沒有變化。免疫印跡結(jié)果也顯示CXCR5在人癲癇組織中的表達(dá)增加，而CXCL13的表達(dá)沒有增加。作者同時使用人類和WT小鼠標(biāo)本來確定CXCR5的模式和定位表達(dá)在亞細(xì)胞定位方面，發(fā)現(xiàn)CXCR5主要與Na+/K+-ATPase共定位，說明CXCR5主要存在于神經(jīng)元膜中。最后，從不同發(fā)育階段的WT小鼠中提取皮質(zhì)問題，并進(jìn)行免疫印跡分析。發(fā)現(xiàn)出生后CXCR5的表達(dá)明顯減少，而CXCL13的表達(dá)保持不變。這些結(jié)果提示CXCR5可能對胚胎發(fā)育起重要作用，并可能在癲癇中發(fā)揮作用。
圖二 CXCR5的上調(diào)或下調(diào)調(diào)控對癲癇發(fā)作的影響
有研究表明CXCR5與癲癇性疾病有關(guān)。作者通過病毒注射上調(diào)或下調(diào)CXCR5。小鼠從出生到成年，沒有觀察到自發(fā)性癲癇發(fā)作；因此，作者在健康的雄性成年小鼠中建立了癲癇模型。PTZ誘發(fā)癲癇發(fā)作是急性癲癇的相關(guān)模型。通過反復(fù)腹腔注射閾下劑量的PTZ來探討隨后癲癇發(fā)作的易感性。采用Racine評分法評估模型小鼠的癲癇發(fā)作情況。在第6天，敲除 CXCR5組小鼠的癲癇發(fā)作評分高于對照組。第8天，注射相同劑量的PTZ后，CXCR5基因敲低的小鼠死亡。第5天，過表達(dá)CXCR5的小鼠在注射PTZ后出現(xiàn)Racine評分下降，并存活到第12天。這表明，改變CXCR5基因的表達(dá)可以影響小鼠對癲癇發(fā)作的易感性；敲除CXCR5會增加癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度和死亡率，而過表達(dá)CXCR5的情況則相反。KA誘發(fā)癲癇是研究癲癇病理生理學(xué)最常用的模型之一。自成年繁殖體的健康雄性小鼠腹腔注射KA以誘導(dǎo)慢性癲癇。由于KA的癲癇發(fā)作持續(xù)約30天，作者進(jìn)行了1-4周的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，抑制組形成慢性癲癇的潛伏期降低，而癲癇持續(xù)狀態(tài)（SE）數(shù)量和持續(xù)時間增加；而CXCR5敲除組則相反。敲除CXCR5增加了SE癲癇發(fā)作持續(xù)時間，而過表達(dá)CXCR5則相反?？傊?，兩種化學(xué)誘導(dǎo)癲癇模型的結(jié)果表明CXCR5可以調(diào)節(jié)癲癇發(fā)作
圖三 CXCR5調(diào)控WT小鼠胚胎遷移神經(jīng)元的運(yùn)動性和多極向雙極性轉(zhuǎn)變
接下來，作者使用宮內(nèi)電穿孔研究了CXCR5對胚胎期神經(jīng)元遷移和極性的影響。宮內(nèi)電穿孔在E14.5時對妊娠小鼠進(jìn)行上調(diào)或下調(diào)CXCR5的表達(dá)，并在妊娠第19天獲得的皮質(zhì)切片進(jìn)行染色，以評估其對神經(jīng)元遷移的影響。作者發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在CXCR5敲除治療后，在IZ和SVZ/VZ中停留的細(xì)胞比例更大。接下來，作者評估了兩個皮質(zhì)區(qū)域的細(xì)胞極性，并顯示出不同的分布。對多極神經(jīng)元和單極神經(jīng)元比例的統(tǒng)計(jì)分析顯示，CXCR5的敲低導(dǎo)致大部分細(xì)胞停留在較低的CP和IZ中。仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞運(yùn)動方向不一致且分散。此外，與對照組相比，CXCR5基因敲除后，多極細(xì)胞的比例顯著增加?？偟膩碚f，通過宮內(nèi)電穿孔敲除CXCR5嚴(yán)重影響了神經(jīng)元的遷移和細(xì)胞的極性，而當(dāng)CXCR5過表達(dá)時，則沒有明顯的缺陷
圖四 體外人干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)育模型及CXCR5的定位
作者應(yīng)用了長期的體外神經(jīng)元培養(yǎng)，并在不同的實(shí)驗(yàn)條件下追蹤單個細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。利用人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)育模型和NSC發(fā)育，胚胎體細(xì)胞被重新編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，隨后分化為成熟的神經(jīng)元。作者鑒定了包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、外胚層分化、神經(jīng)元形成和神經(jīng)元成熟等不同發(fā)育階段的標(biāo)記物，作者在NSC階段應(yīng)用病毒干預(yù)，并將細(xì)胞培養(yǎng)到神經(jīng)元成熟。為了分析CXCR5在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中的亞定位，者選擇了誘導(dǎo)4周和8周的神經(jīng)元。結(jié)果顯示，CXCR5與Na+/K+-ATPase在神經(jīng)元中共定位良好，而在膠質(zhì)細(xì)胞中定位不佳。
圖五 CXCR5對培養(yǎng)4周和8周的人源性神經(jīng)元極性建立的影響
在培養(yǎng)4周時，與對照組相比，敲低CXCR5組原發(fā)和繼發(fā)神經(jīng)突數(shù)量減少。Sholl分析顯示，CXCR5的敲低導(dǎo)致了神經(jīng)元復(fù)雜性的顯著降低。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，敲低CXCR5會導(dǎo)致神經(jīng)元軸突長度的減少，而在過表達(dá)CXCR5的組中，軸突長度不受影響。作者分析神經(jīng)元骨架，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，敲低CXCR5顯著減少了神經(jīng)元分支總數(shù)和總分支長度；然而，過表達(dá)CXCR5沒有影響這些參數(shù)。作者還在第8周應(yīng)用了Sholl分析，發(fā)現(xiàn)CXCR5的敲低顯著降低了神經(jīng)元的復(fù)雜性。下調(diào)組的樹突棘密度明顯低于對照組，但CXCR5過表達(dá)無影響。此外，作者還發(fā)現(xiàn)，在CXCR5基因敲低后，未成熟的樹突棘的百分比顯著增加。對這兩個發(fā)育階段的神經(jīng)元形態(tài)的分析顯示，CXCR5的敲低影響了神經(jīng)元的發(fā)育，包括阻礙了樹突和軸突的形成以及樹突棘的成熟。CXCR5過表達(dá)在第4周促進(jìn)了早期神經(jīng)元的生長，但在第8周并沒有影響神經(jīng)元的成熟。
圖六CXCR5通過穩(wěn)定肌動蛋白的細(xì)胞骨架來調(diào)節(jié)神經(jīng)元的遷移和極化
作者發(fā)現(xiàn)CXCR5蛋白的表達(dá)在胚胎期E17.5達(dá)到峰值，出生后逐漸下降。因此在E17.5時提取了小鼠大腦皮質(zhì)蛋白，并對CXCR5進(jìn)行了蛋白相互作用試驗(yàn)，然后進(jìn)行了蛋白譜分析。作者對這些相互蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)相關(guān)蛋白與細(xì)胞內(nèi)骨架相關(guān)。作者接下來研究了CXCR5調(diào)節(jié)神經(jīng)元遷移和神經(jīng)突生長的機(jī)制。結(jié)果表明，敲低CXCR5降低了F-actin的熒光范圍和熒光強(qiáng)度，而F-Cactin的覆蓋率隨著CXCR5過表達(dá)的增加而增加。作者發(fā)現(xiàn)CXCR5基因敲低增加了肌動蛋白去除因子coflin的磷酸化水平。CXCR5的過表達(dá)導(dǎo)致了F-actin/G-actin比值的增加，因?yàn)?/span>coflin的磷酸化水平降低；使用茉莉素內(nèi)酯也產(chǎn)生了同樣的效果。
圖七 CXCR5對胚胎期和神經(jīng)元成熟期神經(jīng)元興奮性的影響
CXCR5防御導(dǎo)致晚期出生胚胎神經(jīng)元遷移受損和發(fā)育過程中的形態(tài)缺陷；CXCR5的上調(diào)或下調(diào)導(dǎo)致成年小鼠癲癇活動增加。為了探究皮層神經(jīng)元中CXCR5的敲低會導(dǎo)致更高的癲癇易感性，作者在體外神經(jīng)元中使用全細(xì)胞膜片鉗記錄檢測神經(jīng)元的興奮性，發(fā)現(xiàn)靜息膜電位未受到影響。然而，敲除CXCR5增加了誘發(fā)的峰值頻率，這表明CXCR5的防御導(dǎo)致了這些神經(jīng)元放電穩(wěn)定。綜上所述，CXCR5缺陷小鼠對癲癇的易感性較高可能是由于神經(jīng)元放電增加，這可能與異常放電模式有關(guān)。為了闡明CXCR5與癲癇之間的因果關(guān)系，作者在體內(nèi)和體外都進(jìn)行了藥理學(xué)研究。作者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CXCR5被敲除時，茉莉素內(nèi)酯減輕了神經(jīng)元遷移的損傷。作者還發(fā)現(xiàn)，茉莉素內(nèi)酯抵消了CXCR5在神經(jīng)元發(fā)育中的缺陷和CXCR5導(dǎo)致的放電不穩(wěn)定性，導(dǎo)致PTZ誘導(dǎo)的CXCR5防御性動物的癲癇發(fā)作評分降低。
幾乎所有的神經(jīng)元遷移障礙，包括無腦畸形、腦室周圍結(jié)異位和皮質(zhì)下區(qū)異位，都是癲癇發(fā)作的危險因素；然而，它們引起癲癇樣的確切機(jī)制活動未知。據(jù)估計(jì)，局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良與30%的難治性癲癇病例相關(guān)，但在這些患者中，手術(shù)和藥物治療都不令人滿意。此外，抗癲癇藥物通過抑制神經(jīng)元興奮或增強(qiáng)神經(jīng)元抑制來發(fā)揮作用，作者的研究結(jié)果為CXCR5基因靶向治療難治性癲癇提供了一個不同的視角。
https://link.springer.com/article/10.1007/s12264-023-01087-w
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