一、二硫鍵反應(yīng)條件選取
二硫鍵就是指蛋白質(zhì)或多肽分子結(jié)構(gòu)中兩個不同位點Cys的巰基（-SH）被氧化所產(chǎn)生的S-S共價鍵。一條多肽鏈上不一樣的位置的氨基酸中間所產(chǎn)生的二硫鍵，能夠把多肽鏈折疊成特定的空間分布。多肽分子一般來說分子量很大，空間分布繁瑣，結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生二硫鍵時需要兩個半胱氨酸在空間距離上非常接近。另外，多肽結(jié)構(gòu)中還原態(tài)的巰基化學(xué)特性活躍，很容易出現(xiàn)其它的副作用，同時肽鏈上其余側(cè)鏈也可能會出現(xiàn)許多修飾，所以，多肽鏈采取修飾所選擇的氧化劑和氧化條件是反應(yīng)的重要因素，反應(yīng)原理也較為復(fù)雜，既有可能是自由基反應(yīng)，也有可能是離子反應(yīng)。
反應(yīng)條件有許多種選擇，例如空氣氧化，DMSO氧化等溫和的氧化過程，或H2O2，I2，汞鹽等劇烈的反應(yīng)條件。
1、空氣氧化法：
空氣氧化法生成二硫鍵是多肽合成中最具代表性的辦法，一般是將巰基處在還原態(tài)的多肽溶解于水里，在近中性或弱堿性環(huán)境下（PH值6.5-10），反應(yīng)24個小時以上。為了降低分子相互間二硫鍵產(chǎn)生的可能性，這種方法往往需要在較低濃度的環(huán)境下完成。
2、碘氧化法：
將多肽溶解于25%的甲醇水溶液或30%的醋酸水溶液中，逐滴滴加10-15mol/L的碘來進(jìn)行氧化，反應(yīng)15-40min。當(dāng)多肽鏈里面含有對碘特別敏感的Tyr、Trp、Met和His的殘基時，氧化條件要非常精準(zhǔn)，氧化完成后，立即加入維生素C或硫代硫酸鈉清除過多的碘。
二、兩對及多對二硫鍵成環(huán)對策
當(dāng)序列中含有兩對或多對二硫鍵想要成環(huán)時，一般會有自然隨機(jī)成環(huán)和定點成環(huán)兩種情況：
1、自然隨機(jī)成環(huán)指序列當(dāng)中的Cys相互間隨意成環(huán)，與一對二硫鍵成環(huán)條件差不多；
2、定點成環(huán)指序列當(dāng)中的Cys根據(jù)設(shè)計要求產(chǎn)生二硫鍵，反應(yīng)過程相對來說比較復(fù)雜。在固相合成多肽前，需提前制定幾對二硫鍵生成的順序和方法路經(jīng)，選擇適合的側(cè)鏈巰基保護(hù)基，憑借其特性的差異，逐步氧化生成兩對或多對二硫鍵。一般采用的巰基保護(hù)基有trt,Acm,Mmt,tBu,Bzl,Mob,Tmob等基團(tuán)。
相對于二對及多對二硫鍵成環(huán)的多肽，在制定好二硫鍵生成次序及Cys側(cè)鏈保護(hù)對策后，對于每一對二硫鍵成環(huán)后，都會取少部分樹脂切割，并且對切割后產(chǎn)品實施MS檢驗。
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