國立研究開發(fā)法人國立精神神經(jīng)醫(yī)療研究中心( NCNP )神經(jīng)研究所模式動物開發(fā)研究部的工藤もゑ技術專家、Sidikejiang Wupuer研究員、關和彥部長和京都大學靈長類研究所神經(jīng)科學研究部門整合腦系統(tǒng)領域的井上謙一助教和高田昌彥教授等共同研究小組， 利用腺病毒載體( AAV )，成功地將基因選擇性導入了小型靈長類動物——普通狨的痛覺神經(jīng)。 慢性疼痛不僅是特定疾病的患者，也是很多乍一看很健康的人的煩惱。 根據(jù)過去的調(diào)查，據(jù)說每4名日本成人中就有1人患有某種慢性疼痛。 這個慢性疼痛的24%是“神經(jīng)病性疼痛”，也就是身體感覺系統(tǒng)的損傷和疾病引起的疼痛。 神經(jīng)病理性疼痛是一種在皮膚等不被刺激的情況下持續(xù)發(fā)生的疼痛，到現(xiàn)在為止還沒有根本的治療方法。 但是，如果使用目前正在廣泛研究的基因治療技術，也許能夠根治神經(jīng)障礙性疼痛。 例如，有可能在傳達疼痛的末梢感覺神經(jīng)(侵害接受神經(jīng))中選擇性地導入治療相關基因，抑制其活動。 但是，末梢神經(jīng)中除了侵害接受神經(jīng)以外，還混合了傳達自己在運動的神經(jīng)和傳達觸覺的神經(jīng)，因此多年來只能向這種侵害接受神經(jīng)選擇性導入基因是不可能的，但近年來，有人提出了基因治療技術，也許可以做到這一點。 也就是說，這是一種利用腺病毒載體將外源基因選擇性導入侵害接受神經(jīng)的技術。 雖然該技術有可能發(fā)展為創(chuàng)新型人類慢性疼痛治療，但成功病例僅限于小鼠和大鼠等嚙齒類動物，包括人類在內(nèi)的靈長類尚未見報道。 本研究采用同樣的基因?qū)敕椒?，首次在世界范圍?nèi)證明了靈長類動物(狨)也可以導入專門針對侵害接受神經(jīng)的基因。 本研究的成果，有望發(fā)展成為針對為神經(jīng)障礙性疼痛而煩惱的人類患者的、使用了腺病毒載體的新的基因治療方法。 本研究成果于日本時間2021年8月8日21時27分刊登在“molecular therapy-methods & clinical development”在線版上。
研究背景
慢性疼痛不僅是各種疾病的患者共有的，是乍一看很健康的人大多數(shù)都會有的煩惱。 例如，過去的調(diào)查顯示，每4名日本成年人中就有1人患有某種慢性疼痛。 而且，訴說慢性疼痛的人有24%是“神經(jīng)障礙性疼痛”，也就是身體感覺系統(tǒng)的損傷和疾病引起的疼痛。 一旦患上這種神經(jīng)障礙性疼痛，即使皮膚等不被刺激也會持續(xù)疼痛，但很遺憾，根本的治療方法并不存在。 在這樣的背景下，近年來，神經(jīng)病理性疼痛的基因治療方法正在被廣泛研究。 因此，我們的目標是，在感知疼痛刺激的末梢感覺神經(jīng)(侵害接受神經(jīng))中選擇性地導入外源基因，通過抑制其活動來抑制疼痛。 但是，在末梢神經(jīng)中，除了侵害接受神經(jīng)以外，還混雜著傳達自己在運動的神經(jīng)和傳達觸覺的神經(jīng)。 因此，很難只對侵害接受神經(jīng)選擇性地導入基因，是技術上的課題。 但是，最近有劃時代的發(fā)現(xiàn)，利用腺病毒載體，外源基因可以有選擇地導入侵害接受神經(jīng)。 使用該技術，有可能有效治療人類的慢性疼痛。 但是，到目前為止，這種選擇性基因?qū)氤晒Φ睦觾H限于老鼠和大鼠等嚙齒類動物，沒有包括人類在內(nèi)的靈長類中成功的例子。
研究概要
研究小組為了向狨的感覺神經(jīng)細胞導入基因，向坐骨神經(jīng)注入了嵌入了熒光蛋白基因GFP的腺病毒( AAV )載體(圖1A、b )。 為了與先行研究進行比較，對嚙齒類的大鼠也進行了同樣的實驗。 已知AAV根據(jù)其類型不同而對不同的組織和細胞具有指向性(更容易優(yōu)先感染的性質(zhì))，但已知特別是AAV6在嚙齒類中對痛覺神經(jīng)具有指向性。 因此，在實驗中使用了AAV6和作為比較對象的具有觸覺和肌肉感覺指向性的AAV9。 于是，確認了基因按照目的導入了感覺神經(jīng)細胞(圖1 C-F )。 另外，對向靶組織以外導入基因進行調(diào)查時，在比注入載體的部位更遠的脊髓和注入周邊的肌肉中，載體的導入量非常少，確認了對神經(jīng)組織的高選擇性(圖1 G-I )。 接著，確認了感覺神經(jīng)細胞中AAV6和AAV9各自的指向性，關于AAV6，狨也和大鼠一樣具有無髓神經(jīng)細胞的指向性，但關于AAV9，與對有髓神經(jīng)細胞具有指向性的大鼠不同，在狨身上看不到方向性(圖2 )。 在感覺神經(jīng)細胞中，已知無髓神經(jīng)主要與疼痛等痛覺相關，有髓神經(jīng)與觸覺和肌肉感覺相關。 并且，通過病理學檢查，未發(fā)現(xiàn)炎癥性細胞的浸潤等，確認幾乎沒有受到AAV毒性的影響(圖3 )。 最后，確認了感覺神經(jīng)細胞信息傳遞目的地脊髓中AAV6和AAV9各自的指向性。 在脊髓中，也和感覺神經(jīng)細胞一樣，AAV6對狨和大鼠都具有無髓纖維的指向性。 另一方面，關于AAV9，大鼠的有髓纖維具有指向性，而狨的無髓纖維有指向性(圖4 )。 結果顯示，對于狨，選擇AAV6的類型可以選擇性地將基因?qū)胪从X神經(jīng)(圖5 )。 可以認為，此次我們成功導入靈長類痛覺神經(jīng)選擇性基因，是因為選擇了病毒載體直接注入神經(jīng)的給藥途徑。 在以往以靈長類為對象的研究中，大部分使用靜脈給藥和腦脊液給藥，因此沒有對痛覺神經(jīng)獲得選擇性。 雖然不太清楚病毒載體通過血腦屏障向腦神經(jīng)細胞導入基因的結構，但是推測出嚙齒類和靈長類的這個結構有很大的差異。
今后的展望
由于向痛覺神經(jīng)選擇性導入基因的技術不僅在嚙齒類動物中實現(xiàn)了，預計今后不再是導入技術，而是以通過導入什么樣的基因能夠更有效地抑制慢性疼痛為對象的開發(fā)研究將會盛行。 例如，通過引入抑制神經(jīng)活動的治療藥物來抑制疼痛，以及使用目前正在積極研究的光遺傳學和化學遺傳學的治療方法等，有望發(fā)展成許多治療方法。 我們開發(fā)的方法目前需要直接注射到周圍神經(jīng)，所以缺點是技術難度大。 但是，基于這次的發(fā)現(xiàn)，通過臨床上日常進行的向皮膚和肌肉的注射也可以期待同樣的效果。 通過開發(fā)這種新的注入途徑，有可能被確立為神經(jīng)病理性疼痛治療的最簡便有效的方法之一。
圖1:AAV載體的神經(jīng)內(nèi)注入
通過將嵌入了a、b ) GFP基因的AAV載體注入到狨的左側(cè)坐骨神經(jīng)，向感覺神經(jīng)細胞進行基因?qū)搿?/span> C-F ) AAV載體注入1個月后脊髓和后根神經(jīng)節(jié)(白箭頭)中熒光蛋白基因GFP的表達實例。 G-I )向靶部位以外導入AAV載體非常少。 注入部位附近的脊髓( GFP+，h )和遠位的脊髓( GFP-，I )，以及注入部位附近的肌肉(腓腸肌內(nèi)側(cè)頭)和遠位的肌肉(脛前肌)的AAV載體拷貝數(shù)的比較。
圖2 :向感覺神經(jīng)細胞導入熒光蛋白分子和導入指向性感覺神經(jīng)細胞的基因的例子。 感覺神經(jīng)細胞( NeuN，紅色)和神
感覺神經(jīng)細胞的基因?qū)肜?/span> 通過感覺神經(jīng)細胞( NeuN，紅色)和表示神經(jīng)細胞中基因表達的熒光標記( GFP，綠色)的重疊，可以看出AAV6和AAV9載體都將熒光蛋白分子導入了神經(jīng)細胞中( A-D )。 進而，將感覺神經(jīng)細胞區(qū)分為有髓神經(jīng)( E-E”、G-G“、I-I”、K-K“、紅)和無髓神經(jīng)( F-F”、H-H“、J-J”、L-L“、紅)，分別進行區(qū)分 另一方面，在AAV9中，大鼠通過有髓神經(jīng)導入較多基因，而在狨組中，有髓·無髓神經(jīng)在基因?qū)肷暇匆妰?yōu)勢差異( m，n )。
圖3 :蘇木精-曙紅染色的病理學檢查
以服用AAV9的狨( a，b )、大鼠( c )以及服用AAV6的狨( d，e )和大鼠( f )感覺神經(jīng)細胞的蘇木精-曙紅染色為例。 與對側(cè)的控制( g -狨、h大鼠)相比，細胞浸潤的征兆未見顯著差異。
圖4 :熒光蛋白分子在脊髓的導入和定向
導入感覺神經(jīng)細胞的熒光蛋白分子在感覺信息傳遞目的地脊髓也得到了確認(圖4 )。
大鼠脊髓和狨脊髓中AAV6和AAV9的基因?qū)肜?在AAV6中，大鼠和狨都發(fā)現(xiàn)了基因?qū)氲綗o髓的侵害感受性神經(jīng)細胞中( e，I )，但是沒有導入到有髓的軀體感覺相關的神經(jīng)細胞中( f，j )。 另一方面，在AAV9中，發(fā)現(xiàn)大鼠在有髓神經(jīng)中導入了基因( n )，但在狨中被導入了無髓神經(jīng)的一部分( q )，沒有被導入有髓神經(jīng)。 另外，在脊髓前角發(fā)現(xiàn)運動神經(jīng)元中有基因?qū)?/span>( g，k，o，s )。
圖5 :向狨注入AAV6類型的載體后，可以選擇性地向痛覺神經(jīng)導入基因
用語解說
用語解說 腺病毒( AAV )載體: 被期待應用于基因治療的基因?qū)胼d體(基因搬運工)之一。 據(jù)說只引起非常弱的免疫反應，不具有病原性。 具有可以向神經(jīng)細胞等高效導入基因，基因表達長期持續(xù)的特征。 另外，已知根據(jù)AAV的類型分別具有對不同組織的指向性。 后根神經(jīng)節(jié): 將來自末梢感覺感受器的信號傳遞到中樞的感覺神經(jīng)細胞的集合體。 溫覺、觸覺、肌肉感覺等不同種類的神經(jīng)細胞聚集在一起。 感覺神經(jīng)的軸突(從細胞延伸的細長突起)位于進入脊髓之前。
原論文信息
?論文名：” Specific gene expression in unmyelinated dorsal root ganglion neurons in nonhuman primates by intra-nerve injection of adeno-associated virus 6 vector”
?著者：工藤もゑこ、Sidikejiang Wupuer、藤原真紀、齊藤祐子、窪田慎治、井上謙一、高田昌彥、関和彥
?掲載誌：Molecular Therapy - Methods & Clinical Development
?DOI：10.1016/j.omtm.2021.07.009
?URL：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S232905012100126
資助金
本成果主要是在以下研究資助下進行的。 文部科學省科學研究費補助金jp19h 01092，19h 05724，19k 21825，JP17J05310 日本醫(yī)療研究開發(fā)機構JP20dm0307021，JP20dm0207077。
咨詢方式。
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