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一、全球人用疫苗發(fā)展概況
二、人用疫苗的研發(fā)流程
人用疫苗的研發(fā)完全按照新藥研發(fā)的流程進(jìn)行，包括臨床研究、工藝開(kāi)發(fā)和檢定方法研究。臨床研究是按照一定程序在人體中進(jìn)行的疫苗安全性和免疫原性研究，包括臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期試驗(yàn)4個(gè)階段。前3期為疫苗上市前的臨床試驗(yàn)，Ⅳ期為疫苗上市后的臨床試驗(yàn)。檢定方法研究涉及建立全套能夠檢測(cè)原料純度、疫苗產(chǎn)品穩(wěn)定性和效力以及通過(guò)免疫學(xué)和其他標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測(cè)疫苗效力的方法。人用疫苗研發(fā)流程見(jiàn)圖1。
人用疫苗開(kāi)發(fā)的工藝路線見(jiàn)圖2
三、人用疫苗的分類及特點(diǎn)
依據(jù)是否含有活微生物體，將疫苗分成兩大類，即含活微生物體的疫苗（減毒活疫苗、載體疫苗）和不含活微生物體的疫苗（滅活疫苗、組分疫苗和類毒素疫苗）。滅活疫苗包括全微生物體滅活疫苗、裂解疫苗和亞單位疫苗；組分疫苗包括多核酸疫苗（包括mRNA疫苗和DNA疫苗）、多肽疫苗、基因工程亞單位疫苗、多糖蛋白結(jié)合疫苗。
（一）減毒活疫苗
減毒活疫苗是將病原體（細(xì)菌、病毒等）經(jīng)過(guò)處理后，使其毒性減弱，接種到機(jī)體內(nèi)，可引發(fā)免疫反應(yīng)，但卻不會(huì)引發(fā)疾病的一種疫苗。生產(chǎn)減毒活疫苗時(shí)，選用減毒適宜、毒力低而免疫原性和遺傳穩(wěn)定性均良好的菌、毒種，在敏感培養(yǎng)基（細(xì)菌）或適宜動(dòng)物、雞胚和細(xì)胞培養(yǎng)（病毒）中適應(yīng)傳代以獲得較高產(chǎn)量的細(xì)菌或病毒，細(xì)菌、病毒收獲后經(jīng)過(guò)純化即可。接種減毒疫苗后，病原體在機(jī)體內(nèi)有一定程度的生長(zhǎng)繁殖能力，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，獲得的免疫力較持久，因此接種次數(shù)少，受種者反應(yīng)輕微，但可能出現(xiàn)毒力返祖現(xiàn)象。減毒活疫苗還可能誘導(dǎo)免疫缺陷個(gè)體的嚴(yán)重反應(yīng)。另外，活疫苗的穩(wěn)定性較差，保存運(yùn)輸較困難，但在制成凍干疫苗后，可增加疫苗穩(wěn)定性。麻疹疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗以及水痘疫苗等都有減毒活疫苗研制。口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗，具體流程見(jiàn)圖3
（二）載體疫苗
載體疫苗是將病原體的保護(hù)性抗原基因插入質(zhì)粒DNA或細(xì)菌的基因組，然后使之高效表達(dá)而制備的疫苗。載體疫苗在免疫效力上有優(yōu)勢(shì)。載體疫苗用量少，無(wú)需純化抗原，接種后刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，載體可發(fā)揮佐劑效應(yīng)增強(qiáng)免疫效果；比其他制劑具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性和更長(zhǎng)的儲(chǔ)存期；易于接種，適合于大規(guī)模的免疫，免疫途徑簡(jiǎn)單；易大批量生產(chǎn)，成本低。載體通常為特定微生物的疫苗株，如痘苗病毒、腺病毒、卡介苗等。載體疫苗的缺點(diǎn)是機(jī)體內(nèi)針對(duì)載體的抗體（免疫前存在的或免疫后產(chǎn)生的）會(huì)對(duì)相應(yīng)載體疫苗的再次免疫效果產(chǎn)生一定影響。
制備載體疫苗的載體包括重組細(xì)菌載體、重組病毒載體、DNA載體、RNA載體、樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）載體、T細(xì)胞載體以及多肽載體等（表2）。脂質(zhì)體（可降解的生物多聚物）、病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP）和免疫刺激復(fù)合物亦可用于疫苗傳遞系統(tǒng)。其中活的減毒細(xì)菌載體，由于能在接種者體內(nèi)短期存活以及被運(yùn)載的表達(dá)系統(tǒng)可以繼續(xù)復(fù)制等，可以起到抗原放大效應(yīng)［12］。開(kāi)發(fā)載體疫苗的基本原理在于其可以刺激MHC-Ⅰ類分子產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）反應(yīng)，同時(shí)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)編碼抗原的抗體，不同的載體也可以刺激不同的輔助T細(xì)胞成熟［13, 14］。在選擇疫苗載體時(shí)，需要考慮載體是否容易操作、載體容納外源基因的大小、異源蛋白的表達(dá)效率、載體的安全性和載體規(guī)?；a(chǎn)的難易。
解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院將2014年扎伊爾型（Zaire type）埃博拉病毒（Ebola virus，EBoV）糖蛋白（glycoprotein，GP）重組進(jìn)腺病毒5型（Adenovirus 5，AdV-5）復(fù)制缺陷型病毒載體中制備埃博拉病毒病載體疫苗。生產(chǎn)工藝見(jiàn)圖4。
（三）滅活疫苗
滅活疫苗指先培養(yǎng)細(xì)菌或病毒，再用化學(xué)劑或高溫將其滅活而制備的疫苗［17］。狹義的滅活疫苗由整個(gè)細(xì)菌或病毒組成，廣義的滅活疫苗也包括由其裂解片段組成的裂解疫苗，以及將裂解片段進(jìn)一步純化得到的亞單位疫苗。
1.全微生物體滅活疫苗：全微生物體滅活疫苗的生產(chǎn)通常選擇遺傳穩(wěn)定性和免疫原性良好、抗原性較全的細(xì)菌或病毒種，一般毒力較強(qiáng)。需比較研究不同來(lái)源菌毒種的生物學(xué)性狀，包括不同地區(qū)、不同時(shí)間、不同年齡以及疾病不同嚴(yán)重程度的菌毒種；通過(guò)交叉免疫保護(hù)水平的比較，選擇交叉保護(hù)范圍廣、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答水平高的菌毒種。在遺傳穩(wěn)定性方面，需對(duì)菌毒種進(jìn)行純化，如挑選單個(gè)菌落或單個(gè)病毒空斑，經(jīng)傳代擴(kuò)增后與原始菌毒種比較，證明二者主要保護(hù)區(qū)域核苷酸或氨基酸序列的一致性。經(jīng)比較選擇菌毒種后，經(jīng)培養(yǎng)繁殖或接種于動(dòng)物、雞胚、細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖后獲得大量的細(xì)菌或病毒，以化學(xué)滅活劑如福爾馬林或β-丙內(nèi)脂等滅活處理，破壞細(xì)菌或病毒的感染性但仍保留其免疫原性［18］。
全微生物體滅活疫苗生產(chǎn)工藝成熟，穩(wěn)定性高，不具備感染性，在體內(nèi)無(wú)法增殖，較安全；但受種者接種反應(yīng)較大，免疫力持久力差，一般需要接種2~3次。隨著純化技術(shù)在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的應(yīng)用，滅活疫苗隨之改進(jìn)為純化的滅活疫苗。制備此類疫苗過(guò)程中，收獲液含各類有機(jī)物、無(wú)機(jī)物、細(xì)胞和細(xì)胞碎片，需采用各種分離技術(shù)去除雜質(zhì)，對(duì)病毒疫苗中含有的宿主細(xì)胞蛋白殘留量有明確的限度要求。目前使用的滅活疫苗均為純化疫苗，如狂犬病疫苗、乙型腦炎疫苗和傷寒疫苗等。
國(guó)產(chǎn)人二倍體細(xì)胞狂犬病疫苗（human diploid cell rabies vaccine，HDCV），利用生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)人二倍體細(xì)胞（human diploid cell，HDC）MRC-5，在MRC-5細(xì)胞上接種PM毒株；收獲病毒液；超濾濃縮，利用分子篩柱層析純化疫苗原液；β-丙內(nèi)酯滅活病毒；配制形成半成品；再分裝凍干制成疫苗成品。生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)技術(shù)提高了HDC培養(yǎng)規(guī)模，降低了HDCV批次間的差異，保證了疫苗質(zhì)量的穩(wěn)定性和均一性。通過(guò)分子篩柱層析進(jìn)行純化，可有效去除雜質(zhì)。此外，國(guó)產(chǎn)HDCV對(duì)凍干過(guò)程中穩(wěn)定劑和保護(hù)劑的組分和凍干工藝進(jìn)行了優(yōu)化。國(guó)產(chǎn)HDCV熱穩(wěn)定性和效價(jià)穩(wěn)定性良好，質(zhì)量控制和產(chǎn)品關(guān)鍵指標(biāo)已處于較高水平，提高了疫苗的免疫效果和安全性，另外短期免疫效果和8年免疫持久性研究結(jié)果顯示免疫效果良好［19］。從醫(yī)療費(fèi)用方面來(lái)看，國(guó)產(chǎn)HDCV價(jià)格遠(yuǎn)低于國(guó)外HDCV。具體工藝見(jiàn)圖5。
2.裂解疫苗：裂解疫苗為多糖疫苗或蛋白疫苗，是對(duì)微生物進(jìn)一步純化，直至只剩所需抗原成分而產(chǎn)生的。很多侵襲性細(xì)菌的表面覆蓋一層莢膜，主要成分是多糖。多糖疫苗目標(biāo)易確定，但免疫原性弱，誘導(dǎo)的保護(hù)期限有限，對(duì)嬰幼兒的免疫原性有限［20］。在腦膜炎球菌疫苗研發(fā)歷程中，早期開(kāi)發(fā)的是全菌體滅活疫苗，由于接種反應(yīng)大而終止應(yīng)用；之后研發(fā)腦膜炎球菌多糖疫苗，通過(guò)培養(yǎng)A群腦膜炎球菌，收取培養(yǎng)物，殺菌，去菌體，純化制成多糖疫苗，接種多糖疫苗后副作用罕見(jiàn)，對(duì)預(yù)防控制大齡兒童和成人的相關(guān)疾病效果顯著，但臨床研究發(fā)現(xiàn)，年齡<2歲嬰幼兒的免疫應(yīng)答低下甚至缺乏，表明其免疫原性與受種者年齡相關(guān)［20］。目前廣泛使用的多糖疫苗有23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗、傷寒Vi多糖疫苗等［20］。
23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗利用我國(guó)地方醫(yī)院分離出的23個(gè)最常見(jiàn)的致病性肺炎鏈球菌菌株，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)提取莢膜多糖、純化后混合制備而成。23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗的接種對(duì)象為所有>2歲人群，接種反應(yīng)輕微，對(duì)高危人群保護(hù)效果良好，臨床研究顯示，接種后3周左右可產(chǎn)生保護(hù)，保護(hù)期一般≥5年［21, 22］，生產(chǎn)工藝見(jiàn)圖6。
3.亞單位疫苗：亞單位疫苗是從病原體分離提取具有免疫原性的蛋白組分制成，成分更加單一［24］。疫苗接種是目前預(yù)防流感的唯一有效措施，目前廣泛使用的季節(jié)性流感疫苗包括全病毒滅活疫苗、裂解疫苗以及亞單位疫苗。其中全病毒滅活疫苗接種后不良反應(yīng)發(fā)生率較高，使用逐漸減少；流感病毒亞單位疫苗則由于更好的安全性，應(yīng)用逐漸增多。亞單位疫苗質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格，產(chǎn)品純度高，臨床免疫效果顯著，可以提高流感疫苗的安全性，消除了佐劑帶來(lái)的不良反應(yīng)，消除了硫柳汞引起的毒副作用，不良反應(yīng)發(fā)生率低。流感全病毒滅活疫苗的接種對(duì)象為>12歲人群，而流感病毒亞單位疫苗則可用于包括>6個(gè)月人群。
生產(chǎn)3價(jià)流感病毒亞單位疫苗時(shí)，采用WHO推薦的流感甲1（H1N1）、甲3（H3N2）和乙型疫苗株（北半球）分別接種雞胚/細(xì)胞培養(yǎng)，收獲病毒液經(jīng)滅活、濃縮、裂解和純化等工藝處理后制成。來(lái)自雞胚培養(yǎng)的流感病毒亞單位疫苗的制備包括：病毒接種，病毒增殖培養(yǎng)，尿囊液收獲，澄清，超濾濃縮，滅活，裂解和超速離心純化，凝膠過(guò)濾層析純化（超濾），混配，過(guò)濾除菌，分裝，包裝等［25, 26］，生產(chǎn)工藝見(jiàn)圖7。
四）組分疫苗
組分疫苗是指將致病病原體主要的保護(hù)性免疫原組分制成的疫苗，包括核酸疫苗、多肽疫苗、基因工程亞單位疫苗等。
1.多肽疫苗：多肽疫苗即根據(jù)病毒的氨基酸序列合成的一段多肽生產(chǎn)的疫苗，是用化學(xué)合成法合成類似于抗原決定簇的小肽（約20~40個(gè)氨基酸），最早的研究為口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）的單獨(dú)B細(xì)胞抗原表位或與T細(xì)胞抗原表位結(jié)合而制備的合成肽疫苗研究［28］。全球僅有一款多肽疫苗已上市，即2011年獲批上市的古巴的Cimavax-EGF疫苗，用于ⅢB期、Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌的治療性疫苗，Ⅲ期臨床顯示能將受試者5年生存期提高近1倍至14.4%（對(duì)照組為7.9%）［29］。
多肽疫苗生產(chǎn)的核心步驟為多肽的合成、純化，根據(jù)設(shè)計(jì)可能有其他工藝。多肽疫苗具有價(jià)廉、安全、特異性強(qiáng)、容易保存和應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)，但是免疫原性差、功效低以及半衰期短等不足影響其實(shí)際應(yīng)用。可被CTL識(shí)別的肽表位對(duì)預(yù)防感染和慢性病的免疫治療是一種非常有用的免疫原［30］。在設(shè)計(jì)中應(yīng)注意：（1）是否激發(fā)CTL和輔助淋巴細(xì)胞；（2）選擇性結(jié)合MHC-I/MHC-Ⅱ類分子，刺激輔助性T細(xì)胞的功能；（3）與適合的佐劑配伍，促進(jìn)與DC傳遞信號(hào)，活化抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC），促進(jìn)T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)；（4）通過(guò)對(duì)肽的修飾、空間結(jié)構(gòu)的調(diào)整以及聯(lián)合DC等措施，增強(qiáng)肽分子與MHC分子的結(jié)合；（5）通過(guò)化學(xué)修飾，增強(qiáng)肽分子的穩(wěn)定性。
從一個(gè)多肽中利用保護(hù)性抗體鑒別B細(xì)胞表位的設(shè)計(jì)技術(shù)已被證明是可行的，雖然某些保護(hù)性表位在整條多肽鏈中僅具有很弱的免疫原性，但經(jīng)修飾和合理折疊后則可具有良好的免疫原性［25］。有許多設(shè)計(jì)策略可以增強(qiáng)B細(xì)胞表位的免疫原性：（1）融合蛋白，利用基因工程技術(shù)將表位與載體蛋白進(jìn)行融合，形成大的蛋白質(zhì)顆粒，從而增強(qiáng)免疫呈遞能力，融合可以發(fā)生在N末端、C末端或伴侶蛋白的內(nèi)部，以獲得最為有效的免疫原性為基礎(chǔ)；（2）連接體，利用化學(xué)方法將表位肽與載體蛋白（如破傷風(fēng)類毒素）進(jìn)行連接；（3）復(fù)合肽，采用人工合成方式合成彼此連接的肽段重復(fù)陣列。
2.基因工程亞單位疫苗：基因工程亞單位疫苗是利用重組DNA技術(shù)克隆并表達(dá)保護(hù)性抗原基因，它可以是重組體本身或者表達(dá)的抗原產(chǎn)物。表達(dá)外源抗原的表達(dá)系統(tǒng)主要有細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞等。見(jiàn)表3?；蚬こ虂唵挝灰呙绠a(chǎn)量高、穩(wěn)定性好，具有良好的安全性，為增加免疫原性通常使用佐劑。
預(yù)防人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染最有效的手段是接種HPV疫苗。HPV具有嚴(yán)格的種屬特異性和組織特異性，需要宿主細(xì)胞處于特定的分化狀態(tài)，難以在其他動(dòng)物中繁殖或進(jìn)行體外培養(yǎng)，因此HPV疫苗無(wú)法采用傳統(tǒng)方法生產(chǎn)，現(xiàn)在已上市的以及研制中的HPV疫苗大多屬于基因工程VLP疫苗。將HPV L1蛋白體外重組表達(dá)，經(jīng)過(guò)純化并組裝成VLP，吸附佐劑并最后配制成多價(jià)疫苗。HPV VLP在結(jié)構(gòu)和表位上與天然HPV衣殼高度相似，具有良好的免疫原性，但不含有任何基因組成分，不能復(fù)制，安全性高。
HPV疫苗制備過(guò)程中大多有重裝步驟，以實(shí)現(xiàn)VLP的均一性，GSK公司在研發(fā)HPV疫苗時(shí)，首次采用了昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備L1蛋白。首先需要構(gòu)建能夠表達(dá)各型L1蛋白的桿狀病毒株：利用PCR從不同型HPV陽(yáng)性病理組織獲取各型L1核酸序列；將獲得的L1核酸序列通過(guò)克隆技術(shù)構(gòu)建各型L1蛋白轉(zhuǎn)移載體，再進(jìn)一步構(gòu)建穿梭質(zhì)粒；將穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染擬尺蠖細(xì)胞（以下簡(jiǎn)稱Hi5細(xì)胞），獲得能夠表達(dá)L1蛋白的桿狀病毒株［31］；該病毒株可通過(guò)再感染細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。生產(chǎn)工藝見(jiàn)圖8。
Merck公司的Gardasil研制采用的是釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)，首先將HPV基因經(jīng)密碼子優(yōu)化，成為在酵母中能高效表達(dá)的密碼子，然后進(jìn)行超濾、離子交換層析、羥基磷灰石層析等步驟，再在體外解聚，組裝形成均勻一致的VLP，隨后，吸附鋁佐劑制成疫苗［32］。
另外，在生產(chǎn)重組和亞單位等疫苗時(shí)，需要借助細(xì)胞系或微生物作為表達(dá)系統(tǒng)，采用不同的表達(dá)系統(tǒng)也會(huì)對(duì)疫苗生產(chǎn)造成影響，因?yàn)椴煌谋磉_(dá)系統(tǒng)在糖基化、產(chǎn)量、費(fèi)用等方面不同。
3.多糖蛋白結(jié)合疫苗：多糖疫苗對(duì)人體免疫原性較差，特別是兒童。多糖分子小，研究證明只有高分子量的多糖抗原才能誘導(dǎo)人體產(chǎn)生足夠的抗體應(yīng)答。為增加多糖的免疫效應(yīng)，20世紀(jì)80年代開(kāi)始結(jié)合疫苗的研究。
以蛋白為載體的細(xì)菌多糖類結(jié)合疫苗是指采用化學(xué)方法將多糖共價(jià)結(jié)合在蛋白載體上生產(chǎn)的多糖-蛋白結(jié)合疫苗，可以提高細(xì)菌疫苗多糖抗原的免疫原性。結(jié)合疫苗中的蛋白質(zhì)具有胸腺依賴性抗原特征，可將非T細(xì)胞依賴性性質(zhì)的多糖抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門細(xì)胞依賴性抗原，啟動(dòng)T輔助淋巴細(xì)胞，從而產(chǎn)生一系列的免疫增強(qiáng)效應(yīng)。結(jié)合疫苗除可增加?jì)胗變簩?duì)細(xì)菌多糖的免疫效應(yīng)外，有些結(jié)合疫苗可為二聯(lián)疫苗，接種人體后可獲得對(duì)2種疾病的免疫力。2012年5月，2種ACYW135群腦膜炎球菌多糖-蛋白結(jié)合疫苗在美國(guó)注冊(cè)并被推薦為青少年和年輕成年人常規(guī)免疫接種疫苗。
美國(guó)輝瑞公司于2010年初研發(fā)的13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗（包含血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9Ⅴ、14、18C、19A、19F和23F型）通過(guò)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。該疫苗增加了近期發(fā)病率較高的6種血清型肺炎球菌多糖，使其在美國(guó)和發(fā)展中國(guó)家的血清型覆蓋率分別達(dá)到90%和80%以上。該疫苗中每個(gè)血清型細(xì)菌培養(yǎng)收獲后，通過(guò)離心分離、沉淀、超濾和柱層析法來(lái)提純多糖。將肺炎多糖通過(guò)還原氨法與CRM197蛋白直接共價(jià)結(jié)合形成單型肺炎多糖結(jié)合疫苗。CRM197蛋白是一種白喉無(wú)毒突變株表達(dá)的蛋白。對(duì)結(jié)合物的質(zhì)量控制主要包括分析多糖/蛋白比例、分子大小、游離糖及游離蛋白等項(xiàng)目。將13種結(jié)合物原液混合，并用磷酸鋁佐劑吸附后分裝制成白色均勻混懸液。其生產(chǎn)工藝見(jiàn)圖9。13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗覆蓋了13種最常見(jiàn)肺炎球菌血清型，采用結(jié)合疫苗技術(shù)，促成免疫記憶，當(dāng)細(xì)菌入侵時(shí)，能及時(shí)產(chǎn)生抗體；提供長(zhǎng)效保護(hù)，提供更強(qiáng)的保護(hù)力［33］。
（五）核酸疫苗
核酸疫苗分為DNA疫苗和RNA疫苗，是利用現(xiàn)代生物技術(shù)，將編碼某種抗原蛋白的外源基因（RNA或DNA）直接導(dǎo)入動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，從而預(yù)防和治療疾病［34］。
DNA疫苗導(dǎo)入宿主體內(nèi)后，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)病原體的蛋白質(zhì)抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。DNA疫苗易于制備，便于保存，可多次免疫，能誘發(fā)全面免疫應(yīng)答。至今已有艾滋病、流感、單純皰疹、乙型肝炎、瘧疾等多種DNA疫苗進(jìn)行了臨床研究，已有獸用DNA疫苗上市。提高DNA疫苗的抗原表達(dá)，提高免疫原性和抗感染的免疫保護(hù)力，仍是DNA疫苗研究領(lǐng)域中的關(guān)鍵問(wèn)題。另外，DNA進(jìn)入體內(nèi)，存在與人基因組重組的風(fēng)險(xiǎn)，安全性有待驗(yàn)證［35］。
相對(duì)于DNA疫苗，mRNA疫苗是一種比較安全的新型核酸疫苗。mRNA疫苗的分子設(shè)計(jì)及化學(xué)修飾的研究目前主要集中于增強(qiáng)其穩(wěn)定性和免疫原性。mRNA疫苗的傳遞介質(zhì)主要包括脂質(zhì)體、非脂質(zhì)體、病毒、納米顆粒等［36］。mRNA疫苗用于腫瘤、感染性疾病等的防治研究表明其具有良好的效果，有較好的應(yīng)用前景。主要具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）可以表達(dá)任意種類的蛋白，由蛋白疫苗轉(zhuǎn)為mRNA疫苗繞過(guò)現(xiàn)有大部分專利，大規(guī)?；瘜W(xué)合成mRNA技術(shù)已經(jīng)成熟；（2）研發(fā)速度遠(yuǎn)超傳統(tǒng)蛋白疫苗，美國(guó)Moderna公司的新型冠狀病毒mRNA疫苗從開(kāi)始研發(fā)到進(jìn)入臨床，僅用63 d；（3）成本低，序列設(shè)計(jì)及優(yōu)化均通過(guò)生物信息學(xué)完成；（4）非特異免疫性較低，可以反復(fù)多次使用；（5）和滅活或減毒疫苗相比，本身無(wú)感染性，安全性較高；（6）可編碼完整抗原，比多肽疫苗更有效；（7）可模擬天然病毒感染途徑，發(fā)生系統(tǒng)藥效（激活CD8+細(xì)胞）；（8）生產(chǎn)為標(biāo)準(zhǔn)化操作，容易放大生產(chǎn)，周期短，成本低，可應(yīng)對(duì)大規(guī)模突發(fā)性傳染病；（9）DNA疫苗相比不會(huì)引起整合性突變，更為安全；（10）無(wú)需進(jìn)入細(xì)胞核，而DNA疫苗需專門遞送設(shè)備進(jìn)入細(xì)胞；（11）從老鼠到人的轉(zhuǎn)化已得到證實(shí)，DNA疫苗在高等動(dòng)物上效果仍有待確認(rèn)；（12）通過(guò)正常細(xì)胞內(nèi)途徑降解，半衰期可以通過(guò)化學(xué)修飾和導(dǎo)入方法調(diào)節(jié)；（13）易于制備多價(jià)聯(lián)苗，而無(wú)需擔(dān)心穩(wěn)定性；（14）mRNA自身有很強(qiáng)的佐劑效應(yīng)，通過(guò)激活TLRs（Toll-like receptors）使免疫效果增強(qiáng)；（15）安全性在臨床上已得到證實(shí)（Ⅰ期結(jié)果）。然而，mRNA疫苗目前還沒(méi)有上市產(chǎn)品，在有效性和安全性方面仍存在爭(zhēng)議，審批難度較大。
（六）類毒素疫苗
類毒素疫苗是用喪失毒性而保留免疫原性的毒素所制成的疫苗。破傷風(fēng)類毒素（tetanus toxoid，TT）是典型的類毒素疫苗。破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌是破傷風(fēng)的致病因子，在環(huán)境中分布廣泛。當(dāng)破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌的芽孢進(jìn)入?yún)捬醐h(huán)境中，就會(huì)成為能產(chǎn)毒素的菌體。破傷風(fēng)的臨床表現(xiàn)是這種毒素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用所致。1924年，應(yīng)用化學(xué)滅活方法獲得TT研制成功，可在暴露前誘導(dǎo)抗破傷風(fēng)的主動(dòng)免疫，現(xiàn)在仍在廣泛應(yīng)用。在適宜產(chǎn)毒的培養(yǎng)基中培養(yǎng)破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌，過(guò)濾除菌后收獲毒素，甲醛脫毒制成TT，純化后滅菌，最后以鋁鹽或鈣鹽吸附。見(jiàn)圖10。TT穩(wěn)定，在37 ℃下貯存數(shù)周疫苗效力不會(huì)出現(xiàn)明顯下降，但56 ℃ 2 h可破壞TT。TT冷凍后不應(yīng)再使用。
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