慢病毒可快速、高效的將目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組，非常適合用于構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。但慢病毒也有缺點(diǎn)，即使是穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，可能會隨著傳代次數(shù)的增加而慢慢丟失干擾或者過表達(dá)的效率。其中可能是原因是在多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的培養(yǎng)過程中，經(jīng)慢病毒整合的細(xì)胞可能相對于野生型在生長活力沒有優(yōu)勢，因此隨著傳代次數(shù)的增加，經(jīng)整合的陽性細(xì)胞數(shù)目慢慢變少，從而導(dǎo)致效率降低。在這種情況下可以選擇挑選單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株的方式。
1. 轉(zhuǎn)座子
在幾乎所有的基因組中，基因組變異的一個主要原因是轉(zhuǎn)座因子（transposable element，TE）或稱為轉(zhuǎn)座子（transposon）。轉(zhuǎn)座子是基因組中可以自由移動的分散的DNA序列，它們可以將自身從基因組的一個位置直接轉(zhuǎn)移到另外一個位置而不依賴于噬菌體或者質(zhì)粒DNA等原件的幫助。依據(jù)轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座機(jī)制，可分為以下兩種：
（1）逆轉(zhuǎn)座子（retrotransposon)：首先需要認(rèn)識到，轉(zhuǎn)座子是存在于基因組DNA中的，它并不是外來物。因此基因組中的一類轉(zhuǎn)座子可以首先從基因組中轉(zhuǎn)錄出RNA，該RNA有類似逆轉(zhuǎn)錄病毒的作用，該RNA通過逆轉(zhuǎn)錄的方法生成DNA，并整合到基因組中的新位點(diǎn)，這種方式類似于“復(fù)制--粘貼”。逆轉(zhuǎn)座子有LTR和non-LTR兩種。
（2）DNA轉(zhuǎn)座子（DNA transposons）：顧名思義，是直接可以轉(zhuǎn)座的DNA片段，該片段由轉(zhuǎn)座酶催化而轉(zhuǎn)移，這意味著該轉(zhuǎn)座子應(yīng)包含轉(zhuǎn)座酶識別的位點(diǎn)，另外轉(zhuǎn)座的位點(diǎn)可以是隨機(jī)的，也可以是有特定位點(diǎn)的，這依賴于轉(zhuǎn)座酶是否有特異性識別的靶基因序列，如果有則將轉(zhuǎn)座子片段特異的轉(zhuǎn)座到該位點(diǎn)，這就造成了跳躍的現(xiàn)象，因此轉(zhuǎn)座子也叫做跳躍基因。睡美人轉(zhuǎn)座子（sleeping beauty transposon）就是一類DNA轉(zhuǎn)座子。這種方式類似于“剪切--粘貼”。
而依據(jù)轉(zhuǎn)座的啟動方式，則又分為自主轉(zhuǎn)座子和非自主轉(zhuǎn)座子
（1）自主轉(zhuǎn)座子：自主即是不要依賴于其他因素的幫助，可自發(fā)轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座事件。
（2）非自主轉(zhuǎn)座子：需要轉(zhuǎn)座酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等其他因素幫助的轉(zhuǎn)座事件。
轉(zhuǎn)座子
2. 轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)
按照Class I和Class II的分類來看：
（1）作為逆轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的Class I，由于是“復(fù)制--粘貼”的模式，因此逆轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)中一般包含RNA結(jié)合蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶等編碼序列，從而達(dá)到“自給自足，逆風(fēng)翻盤”的效果。
（2）作為Class II的DNA轉(zhuǎn)座子，由于是“剪切--粘貼”的模式，那么剪切需要轉(zhuǎn)座酶來實現(xiàn)，因此在DNA轉(zhuǎn)座子的兩端，會有可供轉(zhuǎn)座酶識別和作用的位點(diǎn)，同時有一些DNA轉(zhuǎn)座子還帶有一些特殊的序列用以識別特定的基因組位點(diǎn)，從而定向轉(zhuǎn)座。
Snipaste_2020-05-07_00-42-07轉(zhuǎn)座子.png
3. 慢病毒與轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的對比
轉(zhuǎn)座子的優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，可承載的基因片段大，無需包裝慢病毒，“后悔”插入還可以刪除，全身而退，一般用于刪除抗性基因/熒光標(biāo)簽，避免和后續(xù)慢病毒等基因編輯工具在篩選標(biāo)記上有沖突。
轉(zhuǎn)座子的缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率低會影響整合效率，質(zhì)粒設(shè)計比較復(fù)雜（大約是因為我不會），異染色質(zhì)化會沉默基因表達(dá)，此時需要加入絕緣子。
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4. 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)學(xué)習(xí)案例：piggyBac插入iCRISPR-Cas9系統(tǒng)
從上面第2點(diǎn)轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)中我們可以看到，DNA轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的成員是最多的，包括大名鼎鼎的睡美人轉(zhuǎn)座子（sleeping beauty transposon，SB）：
關(guān)于SB轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)，這中間還有一個美麗的故事?？茖W(xué)家們猶如王子，喚醒了鮭魚中已經(jīng)失活了千萬年的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，而在這個過程中，生物信息學(xué)分析方法起到了關(guān)鍵的作用。在1997年，Ivics等人通過生物信息學(xué)分析方法，找到了鮭魚轉(zhuǎn)座子的保守序列，從而確定了已經(jīng)滅絕的鮭魚中具有活性的睡美人轉(zhuǎn)座酶的基因序列，隨后對這個古老的轉(zhuǎn)座子進(jìn)行了分子水平的重建，最終成功喚醒了沉睡千萬年的轉(zhuǎn)座子活性，因而得名睡美人。
而今天我們要講的是一個新的人工修飾的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)：piggyBac
piggyBac轉(zhuǎn)座子最初于1983年在飛蛾體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，但直到2005年才成功用于哺乳動物細(xì)胞的基因編輯，它的特點(diǎn)有如下：
（1）作為經(jīng)修飾后的DNA轉(zhuǎn)座子，piggyBac有兩個組成部分，轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶；（2）piggyBac轉(zhuǎn)座酶促進(jìn)轉(zhuǎn)座子的基因組整合，尤其喜好基因組的TTAA位點(diǎn)；
（3）轉(zhuǎn)座酶也能以完全無縫的方式切除轉(zhuǎn)座子，不留下任何序列或突變；
（4）piggyBac具有較大的載貨能力(已證明超過200 kb)，并且沒有已知的上限。
piggyBac質(zhì)粒學(xué)習(xí)
這是我從Addgene上找到的一張piggBac的質(zhì)粒圖譜：
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（1）紅色箭頭所指向的兩個橙色小元件是piggyBac的末端重復(fù)序列（IR），這個序列可被轉(zhuǎn)座酶識別并且切割，同樣這個序列會傾向于轉(zhuǎn)座至基因組的TTAA位點(diǎn)；
（2）可以看到左右兩個IR之間有新霉素和卡那霉素抗性基因（NeoR/KanR），可用于作為篩選標(biāo)記。隨后CMV、T7啟動子后面接著的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）也可以作為篩選標(biāo)記；
（3）除第（2）描述的元件外，我們不難看到在NeoR/KanR兩側(cè)有l(wèi)oxP標(biāo)記，因此在轉(zhuǎn)座子整合成功后，還可以使用Cre將抗生素篩選標(biāo)記切除，以免與后續(xù)基因編輯沖突。需要注意的是使用Cre后，基因組中會留下一個loxP位點(diǎn)，這將改變內(nèi)源性DNA序列，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性；
（4）需要注意piggyBac被整合到基因組之后，該轉(zhuǎn)座子的IR序列還能被轉(zhuǎn)座酶識別，從而完全無縫的切除piggyBac轉(zhuǎn)座子。
下圖則展示了piggyBac從插入到被刪除的過程
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5. piggyBac系統(tǒng)的注意事項
下面根據(jù)所查到的資料以及個人使用經(jīng)驗，羅列自己能想到的使用注意事項：
（1）piggyBac的投遞方式是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，因此細(xì)胞的被轉(zhuǎn)染效率非常重要；
（2）使用piggyBac時，基因被完整地插入基因組，而使用標(biāo)準(zhǔn)的DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時，被插入基因可能出現(xiàn)雙鏈斷裂；
（3）可以通過提高轉(zhuǎn)座酶與轉(zhuǎn)座子的比率提高轉(zhuǎn)座子的整合率；
（4）應(yīng)用piggyBac構(gòu)建過表達(dá)細(xì)胞系的時候需要注意基因過表達(dá)不是越高越好，過高的蛋白表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此轉(zhuǎn)座酶與轉(zhuǎn)座子的比率還需要使用者根據(jù)實際情況決定；
（5）piggyBac傾向于整合到染色質(zhì)開發(fā)區(qū)域，例如啟動子和外顯子區(qū)域，如果細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)經(jīng)歷了重大的重排（如當(dāng)干細(xì)胞開始分化），任何整合的轉(zhuǎn)基因一樣，可能會發(fā)生轉(zhuǎn)基因沉默。因此建議在分化過程中保留篩選標(biāo)記，同時還可以使用PCR跟蹤整合效率；
（6）piggyBac可以和其他基因編輯手段結(jié)合，如CRISPR/Cas9、TALENs和ZFNs等，使得基因編輯更加靈活。例如和CRISPR/Cas9結(jié)合時，piggyBac可作為一個HDR模板被整合到基因組中，而后期還可使用轉(zhuǎn)座酶移除；
（7）piggyBac加載的片段太大時，有可能使ITR的核酸酶位點(diǎn)被破壞，從而防止再次切割。
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最近在師兄DZ的指導(dǎo)下，將iCRSPR作為轉(zhuǎn)座子插入序列，例用piggyBac系統(tǒng)整合到基因組中，成功得到了inducible的CRISPR系統(tǒng)，這讓我一掃之前做IKO系統(tǒng)失敗的陰霾。piggyBac系統(tǒng)的使用，拓寬了我對基因編輯技術(shù)的認(rèn)知，我仿佛像一個饑腸轆轆的人，發(fā)現(xiàn)一扇大門的門縫，驚覺這門外有很多已經(jīng)創(chuàng)造了數(shù)年且我從沒見過的食物。這技術(shù)爆炸的時代，我們不斷的感嘆自己的何其有幸，又不斷懊惱時間的如此有限。個人的力量極其微弱，謹(jǐn)以此小小一文，希望能收獲大家的經(jīng)驗之談，我總是從你們身上學(xué)到許多，感謝。
