端粒和端粒酶的研究及應(yīng)用及如何實現(xiàn)反老還童
生命科學(xué)焦點 如何實現(xiàn)反老還童
摘要：古往今來，“長生不老”成為人們一直追求的夢想，曾經(jīng)有多少人用各種方法來延緩衰老，但終未取得顯著效果。近年來研究證實，端粒縮短導(dǎo)致衰老。本文就端粒、端粒酶與衰老的關(guān)系做一綜述。
關(guān)鍵詞：端粒、端粒酶、衰老
最早觀察染色體末端的科學(xué)家始于19世紀末期，Rabl[1]在1885年注意到染色體上所有的末端都處于細胞核的一側(cè)。20世紀30年代，兩個著名的遺傳學(xué)家McClintock B [2]和Muller HJ [3]發(fā)現(xiàn)了染色體的末端可維持染色體的穩(wěn)定性和完整性。Muller將它定義為“telomere”，這是由希臘詞根“末端”（telos）及“部分”（meros）組成的。30多年前，Hayflick[4]首次提出將體外培養(yǎng)的正常人成纖維細胞的“有限復(fù)制力”作為細胞衰老的表征。在此過程中，細胞群中的大部分細胞經(jīng)歷了一定次數(shù)的分裂后便停止了，但它們并沒有死亡，仍保持著代謝活性，只是在基因表達方式上有一定的改變。于是Hayflick猜測細胞內(nèi)有一個限制細胞分裂次數(shù)的“鐘”，后來通過細胞核移植實驗發(fā)現(xiàn)，這種“鐘”在細胞核的染色體末端——端粒。但端粒究竟是怎樣的復(fù)雜結(jié)構(gòu)呢？Blackburn和Gall[5] 于1978年首次闡明了四膜蟲rDNA分子的末端結(jié)構(gòu)，他們發(fā)現(xiàn)這種rDNA每條鏈的末端均含有大量的重復(fù)片段，并且這些大量重復(fù)的片段多是由富含G、C的脫氧核苷酸形成的簡單序列串聯(lián)而成。在1985年，CW·Greider和EH·Blackburn發(fā)現(xiàn)將一段單鏈的末端寡聚核苷酸加至四膜蟲的提取物中后，端粒的長度延長了，這就說明了確實有這樣的一種酶存在[6]，并將它命名為“端粒酶”（telomerase）。之后，耶魯大學(xué)Morin于1989年在人宮頸癌細胞中也發(fā)現(xiàn)了人端粒酶[7] 。近年來，隨著人體端粒酶的發(fā)現(xiàn)和端粒學(xué)說的提出，已經(jīng)知道決定細胞衰老的“生物鐘”就是染色體末端的端粒DNA，它可隨著年齡的增長而縮短。
一、衰老機理及假說
許多人錯誤的認為，退休是一個人進入生理老年的開端。而老年則是衰老的標(biāo)志，其實，這是不科學(xué)的。人體的所有器官和組織都由細胞組成，但組成器官和組織的細胞有兩大類，即干細胞和非干細胞。人體衰老正是由細胞特別是干細胞衰老引起的。醫(yī)學(xué)家認為，如果人類若能避免一些疾患和意外事故，人類壽命的上限應(yīng)當(dāng)是130歲。在人類基因組計劃之前和進行之中，對長壽的分子生物學(xué)研究就有了許多顯著的成果與發(fā)現(xiàn)?？偟臍w納起來便是：衰老是一種多基因的復(fù)合調(diào)控過程，表現(xiàn)為染色體端粒長度的改變、DNA損傷（包括單鏈和雙鏈的斷裂）、DNA的甲基化和細胞的氧化損害等。這些因素的綜合作用，才造成了壽命的長短。
近幾十年來，隨著現(xiàn)代遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)和分子免疫學(xué)等邊緣學(xué)科的飛速發(fā)展，人們對衰老的機理有了深層次的認識，有許多學(xué)說如遺傳程序?qū)W說、DNA分子修復(fù)能力下降假說、體細胞突變學(xué)說、差錯災(zāi)難學(xué)說和交聯(lián)學(xué)說等已經(jīng)被人們廣泛接受，但端粒學(xué)說剛進入人們的研究范圍。端?？s短可引起衰老，而維持端粒長短的重要活性物質(zhì)便是端粒酶。生物學(xué)家早就發(fā)現(xiàn)一件有趣的事實：就是每一種細胞的壽命都有一定限度，在人工培養(yǎng)條件下，接近這個限度時，哪怕用最好的培養(yǎng)方法都拯救不了既定的命運。像人體的成纖維細胞，據(jù)試驗，最多只能繁殖50代，到那時必然趨于死亡。其他像老鼠的成纖維細胞只能分裂18代，龜?shù)某衫w維細胞分裂110代，如此等等。那么人為什么會衰老，以至走向死亡呢？有研究者對導(dǎo)致人體細胞衰老的原因提出了“程序假說”和“錯誤積累假說”。
人類的細胞并不能無限制地重復(fù)分裂，在分裂50～60次后便會停止。細胞不再繼續(xù)分裂的機體組織，便呈現(xiàn)出衰老和機能低下的狀態(tài)。隨著細胞重復(fù)分裂使端?？s短到一定的長度，從而使細胞停止了分裂。這就是“程序假說”。
細胞分裂的時候，DNA被復(fù)制，但是由于X射線、紫外線、活性氧、有害物質(zhì)的損害，DNA會發(fā)生異常變化，于是DNA在復(fù)制過程中就會產(chǎn)生錯誤。隨著錯誤的積累，生成了異常蛋白質(zhì)，細胞機能變得低下，于是細胞便不能繼續(xù)分裂，呈現(xiàn)出了衰老跡象。這就是所謂“錯誤積累假說”。
因此，人不像機器那樣容易磨損和壞掉，而是能自我成長和修復(fù)，但這只能算是衰老的伴生現(xiàn)象。對衰老機理的研究就是為了有效地指導(dǎo)抗衰老的研究和實踐工作。但是，人類衰老的原因是多方面的，衰老的機理也是極為復(fù)雜的。
二、端粒和端粒酶
端粒是真核細胞內(nèi)染色體末端的DNA重復(fù)片斷，經(jīng)常被比做鞋帶兩端防止磨損的塑料套，由富含G的核酸重復(fù)序列和許多蛋白質(zhì)組成，包括Ku70、Ku80、依賴DNA的蛋白激酶和端粒重復(fù)序列結(jié)合因子2（TRF2）等。不同個體的端粒初始長度差異很大，在人中大約為15 kb，在大鼠中可長達150 kb，在小鼠中一般在5～80 kb之間變化，而在尖毛蟲中卻只有20 bp。在所有的有機體中，端粒DNA的長度總是隨著外界環(huán)境而波動變化的。酵母的端粒DNA在200～400 bp間隨遺傳或營養(yǎng)狀態(tài)的改變而改變，四膜蟲和錐蟲等有機體的端粒長度在對數(shù)期會持續(xù)增加。相反，在人體中，隨著細胞的持續(xù)分裂，端粒會緩慢縮短。細胞培養(yǎng)研究表明，當(dāng)端粒再也無法保護染色體免受傷害時，細胞就會停止分裂，或者變得不穩(wěn)定。其功能是完成染色體末端的復(fù)制，防止染色體免遭融合、重組和降解。染色體復(fù)制的上述特點決定了細胞分裂的次數(shù)是有限的，端粒的長度決定了細胞的壽命，故而被稱為“生命的時鐘”。
端粒酶（或端粒體酶）是一種能延長端粒末端的核糖蛋白酶，主要成分是RNA和蛋白質(zhì)，其含有引物特異識別位點，能以自身RNA為模板，合成端粒DNA并加到染色體末端，使端粒延長，從而延長細胞的壽命甚至使其永生化[8]。如果細胞被病毒感染，或者某些抑癌基因如p53、pRB等突變，細胞可越過M1期而繼續(xù)分裂,端粒繼續(xù)縮短，最終達到一個關(guān)鍵閾值，細胞進入第二致死期M2，這時染色體可能出現(xiàn)形態(tài)異常，某些細胞由于端粒太短而失去功能，從而導(dǎo)致細胞死亡。但極少數(shù)細胞能在此階段進一步激活端粒酶，使端粒功能得以恢復(fù)，并維持染色體的穩(wěn)定性，從而避免死亡。最近Shay et al[9]在Science上發(fā)表了一幅有趣的模式圖，簡要介紹了端粒、端粒酶介導(dǎo)細胞凋亡或永生化的過程。
大量的證據(jù)表明，端粒酶的激活或抑制會導(dǎo)致細胞永生化或進入分裂終止期。端粒酶在超過80%的永生細胞系及大多數(shù)腫瘤組織中呈激活狀態(tài)。端粒酶的抑制會使胚胎干細胞、骨髓造血細胞的增生受到抑制,并使腫瘤細胞系增生減弱，以致于凋亡增加。有必要指出的是：端粒酶對細胞增生、衰老及凋亡的調(diào)節(jié)是通過不同的途徑進行的。其中端粒延長依賴性機制作用緩慢，需要多代細胞端粒的進行性縮短積累到一定程度，才會誘發(fā)細胞靜止信號的激活。最近有一種端粒延長非依賴性機制，其作用較快，可能涉及到端粒三級結(jié)構(gòu)的改變，蛋白相互作用的改變,轉(zhuǎn)位的改變等[10]。
三、端粒及端粒酶與衰老的關(guān)系
關(guān)于端粒丟失同衰老的關(guān)系理論是由Olovnikov博士于1973年首次提出的[11]。他認為，端粒的丟失很可能是因為某種與端粒相關(guān)的基因發(fā)生了致死性的缺失。目前認為，人類細胞內(nèi)端粒酶活性的缺失將導(dǎo)致端?？s短，每次丟失50～200個堿基，這種縮短使得端粒最終不能被細胞識別。端粒一旦短于“關(guān)鍵長度”，就很有可能導(dǎo)致染色體雙鏈的斷裂，并激活細胞自身的檢驗系統(tǒng)，從而使細胞進入M1期死亡狀態(tài)。隨著端粒的進一步丟失，將會發(fā)生染色體重排和非整倍體染色體的形成等錯誤，這將導(dǎo)致進一步的危機產(chǎn)生，即M2期死亡狀態(tài)。當(dāng)幾千個堿基的端粒DNA丟失后，細胞就停止分裂而引起衰老。端粒及端粒酶涉及衰老最有力的證據(jù)是Bodnar[12]等證實的。如果細胞試圖要維持其正常分裂，那么就必須阻止端粒的進一步丟失，并且激活端粒酶。Cooke[13]等認為，由于人體細胞中的端粒酶未被活化，從而導(dǎo)致了端粒DNA縮短。因此，只有那些重新獲得端粒酶活性的細胞才能繼續(xù)生存下去，對于那些無法激活端粒酶的細胞將只能面臨趨向衰老的結(jié)果。研究人員最近還發(fā)現(xiàn)，患有一種可加速衰老的遺傳病人具有異常短的端粒，這進一步表明端粒在衰老過程中所起的重要作用。在人類細胞中，研究者還發(fā)現(xiàn)，端粒縮短的速率與細胞抗氧化損傷的能力相關(guān)。更容易遭受氧化損害的細胞，其端?？s短更快，然而那些更能抵抗這種損傷的細胞，端?？s短得較慢。如果能減免細胞損傷或激活端粒酶，即可控制人類的衰老進程。
有人曾經(jīng)對人淋巴細胞的衰老性變化與其端粒長度以及端粒酶活性的關(guān)系在各種體內(nèi)體外環(huán)境及處理因素下做了觀測，發(fā)現(xiàn)端粒酶活性和端粒長度的調(diào)節(jié)有可能是淋巴細胞增殖的控制因素，這已在人體淋巴細胞的發(fā)育、分化、激活和衰老過程中被驗證。曾發(fā)現(xiàn)外周血CD+4T細胞的端粒長度在體內(nèi)隨著衰老以及從靜息細胞到記憶細胞的分化過程而縮短，在體外則隨著細胞的分裂而縮短，這些結(jié)果提示端粒長度與淋巴細胞增殖過程以及記憶性增殖潛力相關(guān)。
端粒酶的表達已知能夠抑制衰老，而Weinberg and colleagues[14]認為端粒酶的作用主要在于延長了端粒懸垂的長度。細胞的復(fù)制期限被認為由最終導(dǎo)致衰老的兩個機制決定，一個是累積的DNA損傷，另外一個是端粒的進行性縮短。Weinberg and colleagues研究了一個端粒的特殊懸垂結(jié)構(gòu)在衰老過程中的作用，懸垂結(jié)構(gòu)只在富含C的末端之外還有一個由幾百個核苷酸組成的富含G的結(jié)構(gòu)。據(jù)稱Shay實驗小組[15]的研究策略是通過抑制端粒酶活性，從而迫使永生化細胞轉(zhuǎn)變?yōu)檎＜毎?，進入正常的衰老和死亡模式。
在衰老異常發(fā)展中有一種早衰人群，即從20歲開始皮膚和毛發(fā)等便迅速衰老，其原因仍在于制造端粒酶的遺傳基因。細胞在分裂的時候，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以其一根長鏈為“模子”進行DNA復(fù)制。在DNA修復(fù)損傷的時候，“拆解”DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)是必要的，制造端粒酶的遺傳基因在解開DNA螺旋結(jié)構(gòu)上起作用。像制造端粒酶并從事DNA復(fù)制和修改錯誤的一類遺傳基因，若與延長細胞壽命的端粒酶良好結(jié)合，我們也許能期待向“長生不老”的目標(biāo)進一步接近。
四、展望和未來
總之，人類體細胞在復(fù)制衰老過程中產(chǎn)生的端粒丟失現(xiàn)象已在體外得到了證實，而且體內(nèi)的端粒丟失可作為判斷供體年齡的依據(jù)。 我們只要設(shè)法使已衰老的人體內(nèi)各種干細胞的端粒長度恢復(fù)到年輕時的水平，老人就會返老還童和長生不老。但在人類端粒及端粒酶的基礎(chǔ)研究中，還存在著許多難點，如：人端粒末端的精細結(jié)構(gòu)，端粒的非端粒酶延伸機制；人端粒酶的具體結(jié)構(gòu)及其基因所在的位置；端粒酶的激活機制及其活性調(diào)節(jié)等，均有待于回答。盡管如此，我們似乎仍看到了前景的美好。畢竟人們已找到了同衰老有著緊密相關(guān)性的因素——端粒和端粒酶。人們對于端粒抑制劑的研究已經(jīng)蓬勃的展開了。故進一步研究端粒酶的活性調(diào)節(jié)機制，對于開發(fā)新型延緩衰老的端粒酶抑制劑無疑具有重要意義。Colorado大學(xué)的兩位研究人員Thomas Cech 和Robert Weinbrg[16]博士已獨立地克隆出一種控制人類細胞端粒酶活性的基因。應(yīng)用這種基因，很有可能得到一種新的蛋白質(zhì)——端粒酶的控制劑。
關(guān)于衰老機理和抗衰老的研究領(lǐng)域現(xiàn)在仍然是非?；钴S的，并將受到越來越足夠的重視，因為它對于延緩衰老，實驗老年醫(yī)學(xué)研究的目的即防止人類早衰，保持人體健康長壽是極為重要的。但是，就目前人類在這方面的研究來看還很薄弱。在今后一個時期內(nèi)，有關(guān)衰老與抗衰老的研究重點還應(yīng)放在以最新生物學(xué)技術(shù)研究有關(guān)長壽與衰老基因的克隆、結(jié)構(gòu)分析以及對這些基因的調(diào)控機制；機體衰老過程中自由基、突變以及其它有害刺激因素啟動細胞衰老凋亡的分子機制和這些過程被調(diào)控的分子機理；利用衰老基因與長壽基因的研究成果進行的基因治療方面研究等。
參考文獻
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作者：蔡軍 黃雪梅（浙江省湖州師范學(xué)院生命學(xué)科學(xué)院 313000）
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