1．5．1 PCR的操作注意事項(xiàng)
◆模板：
PCR所用的模板一般稀釋至納克數(shù)量級(jí)，并保存于-20。C。閉環(huán)DNA模板的擴(kuò)增效率略低于線性DNA。當(dāng)使用高分子量的DNA（>10kb）作模板時(shí)，如用限制性內(nèi)切酶先行消解（靶序列中沒有此酶切位點(diǎn)），則擴(kuò)增效率更好。
PCR所用的模板一般使用量為：
哺乳動(dòng)物基因組DNA  1.0ug DNA。
酵母                 1~10ng
細(xì)菌                 10ng~100ng
質(zhì)粒                 0.1ng~10ng
◆引物：
標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)（不限制引物數(shù)量）每條引物的典型濃度時(shí)0.1~0.5umol/L（即6×1012~3×1013個(gè)分子）。該濃度擴(kuò)增1kbDNA片段少于30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)綽綽有余，更高濃度的引物可能引起錯(cuò)配，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。
買來的引物應(yīng)先離心幾秒鐘后，加入一定量的TE至引物濃度為40μM，保存于－20。C。
使用時(shí)，稀釋成20uM，避免反復(fù)凍融。
◆dNTP：
在MgCl2  1.5mmol/L條件下，每種dNTP的濃度一般在200~250umol/L之間。
高濃度dNTP（>4mmol/L）對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)起抑制作用。因?yàn)閐NTP與Mg2+螯合而引起。如擴(kuò)增片段在約1kb長(zhǎng)度。每種dNTP濃度控制在20 umol/L至0.5~1.0pmd/L，可能會(huì)使擴(kuò)增產(chǎn)物獲得滿意產(chǎn)率。
普通PCR用的dNTP濃度為2.5mM，保存于-20。C避免反復(fù)凍融。
在-20。C長(zhǎng)期保存的dNTP少量水分會(huì)蒸發(fā)，然后凝結(jié)在管壁上，因此使用前要離心幾秒鐘。
◆Mg2+：
通常緩沖液中Mg2+最佳濃度時(shí)1.5mmol/L。
適當(dāng)增加Mg2+濃度可以減少非特異性引導(dǎo)。
◆DNA聚合酶：常規(guī)PCR。 rTaqE每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的25~50ul反應(yīng)體系用0.5~2.5單位。