在高中《生物》的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，“葉綠體中色素的提取與分離”實(shí)驗(yàn)既比較復(fù)雜又非常重要。其中提取綠色葉片中的色素是這一實(shí)驗(yàn)中最關(guān)鍵的步驟。色素提取液的質(zhì)量直接影響到分離效果的好壞乃至整個(gè)實(shí)驗(yàn)的成敗?！渡飳W(xué)教學(xué)》近幾期刊登了幾位作者對(duì)這一步驟的改進(jìn)，筆者通過實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)原理提出了新的見解，并據(jù)此對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了改進(jìn)。
一、關(guān)于丙酮的用量
教材要求研磨時(shí)加2毫升丙酮，由于丙酮揮發(fā)性太強(qiáng)，研磨后只能形成糊狀物，難以過濾出濾液。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，將丙酮的用量提高到7～10毫升較好。
二、關(guān)于碳酸鈣的作用
葉綠素是一種含鎂的化合物，其中的鎂易被H-、Cu2+、Zn2-等取代。當(dāng)被H-取代后，就形成去鎂葉綠素，呈黃褐色。雖然研磨過程中不發(fā)生產(chǎn)生大量H+的化學(xué)反應(yīng)，但液泡中常含有多種有機(jī)酸。一般認(rèn)為，碳酸鈣的作用在于中和研磨過程中產(chǎn)生的H+，以防止葉綠素被破壞。實(shí)驗(yàn)證明，不加碳酸鈣研磨產(chǎn)生的色素提取液與相同條件下加碳酸鈣研磨產(chǎn)生的色素提取液顏色相差無幾，可見色素的損失并不大。但將提取液加塞后在暗處放置幾小時(shí)，前者變黃而后者無顯著變化，說明前者葉色素容易遭到破壞、證明碳酸鈣確能防止色素的破壞。
三、關(guān)于研磨的問題
教材要求“迅速充分地研磨”?！把杆佟碑?dāng)然是為了縮短研磨時(shí)間，以減少丙酮的揮發(fā)?！俺浞帧币_(dá)到什么程度呢？實(shí)驗(yàn)證明，用5克綠葉加10毫升丙酮及少許二氧化硅和碳酸鈣，迅速研磨1分鐘左右，此時(shí)葉片未被研細(xì)，尚有很多葉片呈碎片狀，顯然研磨并不充分(本文姑且稱這種研磨程度為“研磨適當(dāng)”)，但過濾后能得到濃綠的色素提取液。用這種提取液在濾紙條上重復(fù)劃線8次后分離，色帶仍較淡，說明這種色素提取液濃度還是小。
實(shí)驗(yàn)時(shí)常有一些學(xué)生為了“研磨充分”而出現(xiàn)研磨時(shí)間過長(zhǎng)的問題。這時(shí)所有的葉片均被研細(xì)，與丙酮混合成糊狀勻漿(本文姑且稱這種研磨程度為“研磨過度”，實(shí)際上恰是“研磨充分”)。這時(shí)無論研磨前是否加碳酸鈣，濾液均呈黃色。這樣的濾液無法用于分離實(shí)驗(yàn)。顯然，“迅速”和“充分”在這里發(fā)生了矛盾?！把杆佟眲t不充分，“充分”濾液卻呈黃色。對(duì)這一現(xiàn)象的解釋，一種流行的觀點(diǎn)認(rèn)為研磨時(shí)間過長(zhǎng)使色素遭到破壞造成了濾液呈黃色。但細(xì)心觀察就會(huì)發(fā)現(xiàn)，這時(shí)的濾渣仍為濃綠色。將濾渣倒回研缽，再加5毫升丙酮，攪拌均勻后進(jìn)行二次過濾。結(jié)果無論研磨前是否加了碳酸鈣，濾液均呈極濃的綠色，在0.5厘米內(nèi)徑的小試管中幾乎不透明，比研磨適當(dāng)時(shí)得到的色素提取液要濃得多。這種提取液用于分離，效果很好?？梢?，色素并沒有因研磨時(shí)間過長(zhǎng)而被破壞，研磨時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)濾液呈黃色是因?yàn)樯乇晃降綖V渣中，沒能進(jìn)入濾液。
是什么原因造成了這種吸附呢？取上述研磨過度時(shí)的濾渣(色素均吸附在其中)3毫升左右放入試管中，再加入2毫升丙酮，振蕩均勻后靜置，幾分鐘后出現(xiàn)極濃綠的澄清液，說明色素被提取出來了。然后問試管中逐滴滴入清水，每滴5滴振蕩均勻后靜置，觀察顏色變化，發(fā)現(xiàn)滴入水量越多，澄清液顏色越淺，同時(shí)濾渣顏色越深。5～6次后(已滴入1～1.5毫升水)，澄清液呈淺黃綠色，色素又重新被吸附到濾渣中。將這些淺黃綠色的澄清液(主要是水和丙酮的混合物)倒出，向試管中的沉淀渣中再加2毫升丙酮，振蕩后靜置，澄清液再次呈濃綠色，如此可反復(fù)進(jìn)行?？梢姡啬芊癖惶崛〕鰜?，關(guān)鍵在于提取液中丙酮與水的比例。這實(shí)質(zhì)上是一個(gè)溶解問題。若含水多，由于這些色素均不溶于水，則色素被吸附在濾渣中，濾液呈黃色；若含丙酮多，則色素溶解進(jìn)入濾液，濾液呈綠色。5克新鮮菠菜葉中含有相當(dāng)數(shù)量的水，當(dāng)加入的丙酮量一定時(shí)，研磨時(shí)間越長(zhǎng)，丙酮揮發(fā)越多，研磨液中剩余的丙酮比例就越小，提取出的色素也就越少，以致呈黃色。
如果用干燥劑對(duì)色素提取液進(jìn)行吸水處理，效果如何呢？將研磨適當(dāng)?shù)奶崛∫杭?～5克無水硫酸鈉后再過濾，所得濾液比加硫酸鈉前的提取液顏色稍深。但從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，這種提取后去除水的方法濾液損失多，且效果并不很顯著，同時(shí)增加了實(shí)驗(yàn)步驟和藥品消耗，使實(shí)驗(yàn)復(fù)雜化，不宜采用。
用研磨適當(dāng)時(shí)產(chǎn)生的濾渣加5毫升丙酮二次提取。結(jié)果這第二次濾液比第一次濾液色澤還濃綠，說明濾渣中仍有大量色素。但這研磨適當(dāng)時(shí)的二次濾液比研磨過度時(shí)的二次提取液還是淡得多，這是因?yàn)榈谝淮芜^濾時(shí)已有一部分色素進(jìn)入了濾液，而更重要的是因?yàn)檠心ゲ怀浞郑仉y以從葉綠體中提取出來。
怎樣才能既利用了研磨充分時(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)得到充分破壞使色素易于提取這一優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又提高提取液中丙酮的比例呢？經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，筆者進(jìn)行了如下改進(jìn)：采用室內(nèi)預(yù)先陰晾半天的葉片3克(經(jīng)測(cè)定，新鮮時(shí)重5克以上，即減少水2克以上)，加3毫升丙酮及少許二氧化硅和碳酸鈣，將葉片充分研細(xì)，再加入5毫升丙酮，攪拌均勻后過濾。所得提取液色素雖不如研磨過度時(shí)濾渣二次提取液濃，但比研磨適當(dāng)時(shí)的提取液濃得多。若研磨后直接過濾，再用5～7毫升丙酮分2～3次洗滌濾渣，所得提取液更濃，只是操作稍復(fù)雜一點(diǎn)。
這一改進(jìn)提高了色素提取液的濃度，減少了劃線重復(fù)次數(shù)，提高了分離后色素帶的清晰度，同時(shí)又不需二次過濾，是一種較好的實(shí)驗(yàn)方案。采用這一方案后，學(xué)生實(shí)驗(yàn)的成功率基本上達(dá)到100％，且分離效果良好。
呂維棟，生物學(xué)教學(xué)，1996年第1期
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