農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)JOURNAL OF AGRICULTURAL
BIOTECHNOLOGY
1998年 第3期 No.3 1998
科技期刊大豆花葉病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展
王升吉1 吳元華2
(1 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所，濟(jì)南 250100；2 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)系，沈陽(yáng) 110161)
摘 要： 大豆花葉病毒(SMV)基因組結(jié)構(gòu)與其它馬鈴薯Y病毒組成員一樣，是一條單鏈正意RNA，全長(zhǎng)約10 000個(gè)核苷酸。整個(gè)基因組按一個(gè)閱讀框架翻譯，產(chǎn)生一個(gè)多聚蛋白前體，并通過(guò)蛋白酶切加工，形成不同功能的成熟蛋白：35K(P1)、HC、42K(P3)、CIP、6K、21K(Vpg)、27K(NIa)、NIb、CP?；蚪M翻譯產(chǎn)物的加工由三種病毒蛋白酶的參與，即：P1(35K)、HC和27K(NIa)。酶切加工產(chǎn)生的各種功能蛋白在病毒基因的復(fù)制、翻譯、加工等整個(gè)生活史中發(fā)揮重要作用。
關(guān)鍵詞：大豆花葉病毒； 多聚蛋白； 蛋白酶
大豆花葉病毒(Soybean Mosaic Virus,SMV)是馬鈴薯Y病毒組(Potyvirus)成員之一，是世界上廣泛分布的一種病毒，我國(guó)該病毒發(fā)生普遍，引起大豆植株矮化、葉片皺縮、花葉、頂枯、種粒斑駁等癥狀，造成10%～30%的減產(chǎn)，嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量、質(zhì)量及出口創(chuàng)匯［1］。本文擬就SMV分子生物學(xué)的研究進(jìn)展作一綜述。
1 SMV基因組的結(jié)構(gòu)和組成
1.1 SMV基因組的特點(diǎn)
關(guān)于SMV基因組的基本特點(diǎn)，最早報(bào)道于1980年(Hill)［2］。該病毒基因組是單鏈正意RNA，全長(zhǎng)約10 000個(gè)核甘酸，5′端有一共價(jià)鍵連接的金屬蛋白〔Vpg〕，3′端有一個(gè)Poly(A)尾巴，整個(gè)基因組按一個(gè)閱讀框架進(jìn)行翻譯，產(chǎn)生一個(gè)大的多聚蛋白前體，并通過(guò)翻譯時(shí)(后)的蛋白加工過(guò)程，切割形成不同功能的成熟蛋白［3］。與李痘病毒(plum poxvirus，PPV)、煙草脈斑駁病毒(tobacco vein mottle virus，TVMV)的多聚蛋白前體起始翻譯在基因組的第二、三個(gè)AUG密碼子不同的是，SMV基因組翻譯成多聚蛋白起始于基因組的第一個(gè)AUG密碼子，而終止密碼子UAA在位點(diǎn)9330處。
1.2 SMV基因組結(jié)構(gòu)
Ch.Jayaram等人(1992)［4］確定了大豆花葉病毒(SMV)G2、G7株系的基因組全長(zhǎng)序列，與Potyvirus其它成員相似，其基因組全長(zhǎng)序列為9 588 nt(3′端的Poly(A)序列除外)，經(jīng)翻譯產(chǎn)生的多聚蛋白前體為3 066個(gè)氨基酸。通過(guò)分析基因組翻譯產(chǎn)物多聚蛋白裂解成的各個(gè)功能蛋白，推斷出SMV基因組RNA的基因排列順序，從5′-末端到3′-末端依次為：5′-NTR(non-translation region)、編碼P1(35K)、HC(Helper component protease)、P3(42K)、CIP(Cylindrical Inclusion,CIP)、6K(功能未知)、Vpg(21K，Virial Protein Genomic-linked)、NIa(27K,Nuclear Inclusion a)、NIb(Nuclear Inclusion b)、CP(Coat Protein)的基因和3′-NTR(non-translation region)。
在基因組5′-NTR有一段前導(dǎo)序列，長(zhǎng)度在85(PRSV)到205(TVMV)個(gè)核苷酸之間，這一序列有一共同特點(diǎn)，富含A而少G，在SMV中A近40%而G還不到1% 。5′端前導(dǎo)序列還有一個(gè)共同的保守序列，稱為“Potybox”TCAACACAACAT。推測(cè)該保守序列在病毒生活史中起重要作用：如Vpg在5′端的結(jié)合過(guò)程，基因組RNA的翻譯、復(fù)制等［5］。在3′-NTR，不同的Potyvirus成員之間在大小、序287列及預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)等都有很大的差異，而同種病毒的不同株系間其保守性卻比外殼蛋白的還要強(qiáng)，常作為Potyvirus分子分類的依據(jù)。Brgan,G.T等人在Potyvirus的3′—NTR發(fā)現(xiàn)發(fā)卡狀二級(jí)結(jié)構(gòu)，在SMV中也發(fā)現(xiàn)這種類似結(jié)構(gòu)5′GTGGTCTAACCAC3′，這種結(jié)構(gòu)在負(fù)鏈RNA的復(fù)制起始中發(fā)揮作用［6］。關(guān)于SMV基因組各基因及編碼蛋白大小見表1。
2.3 SMV基因組同源性
關(guān)于SMV各株系間，以及SMV與PVY組其它成員之間同源性問(wèn)題，Ch.Jayarm做了研究，SMV的G2和G7之間核苷酸、氨基酸序列的同源性分別為94%和97%，其中明顯的變異主要發(fā)生在基因組5′端區(qū)域，G2與Potyvirus其它成員的氨基酸序列同源性也作了比較(表2)。從表中可看出，在Potyvirus 5個(gè)成員中5′端的35K(P1)、42K(P3)的同源性最差，最保守的區(qū)域?yàn)镃I蛋白、NIb蛋白和外殼蛋白。從NIb、CIP和21K蛋白看，SMV與PPV同源性最高，而SMV CP與PVY和TEV CP同源程度最高。綜合結(jié)果，SMV與PPV同源性最高。
表1 SMV基因組基因核苷酸數(shù)及其編碼蛋白氨基酸數(shù)
Table 1 The nucleotides of the SMV Genomic genes and the amino acids of proteins encoded by virus genes
基因
Gene 5′-NTR 35K HC 42K CIP 6K Vpg NIa NIb CP 3′-NTR 合計(jì)
Total
核苷酸數(shù)
nt 131 924 1371 1197 1903 161 567 729 1551 795 259 9588
編碼蛋白氨基酸數(shù)
aa. NA 308 457 399 634 54 189 243 517 265 NA 3066
注：NA表示不編碼 表2 SMV G7株系與potyvirus其它成員(包括SMV G2株系)基因組編碼功
能蛋白氨基酸序列同源性比較(%)
Table 2 Percentage amino acid sequence identity of predicted mature proteins of SMV
strain G7 with those of other potyviruses including SMV strain G2(Jayaram,1992)
Virus SMVG7
35K HC 42K CIP 6K 21K 27K Nib CP
G2 94 98 94 96 100 99 99 98 99
PPV 14 44 29 72 32 53 48 60 51
TVMV 6 45 13 51 32 45 47 54 52
PVY 13 37 17 52 32 45 35 56 64
TEV 9 43 25 51 45 46 34 55 60
2 基因組翻譯產(chǎn)物的加工和功能
2.1 基因組翻譯產(chǎn)物的加工
Vanoe,V.B等(1984)認(rèn)為，SMV基因組RNA產(chǎn)生的多聚蛋白前體也有類似其它馬鈴薯Y病毒成員的蛋白加工過(guò)程［3］。即通過(guò)翻譯時(shí)或翻譯后的蛋白酶解加工過(guò)程，將多聚蛋白前體酶解為9個(gè)結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物(功能蛋白)：35K(P1)、HC、42K(P3)、CIP、6K、21K(Vpg)、27K(NIa)、NIb、CP(圖1)。SMV的基因組多聚蛋白的酶解加工過(guò)程由3種病毒蛋白酶的參與，即：P1 (35K)、HC和NIa蛋白酶。其酶解加工過(guò)程可參考TEV的(圖2)，三種蛋白酶的功能見后面基因產(chǎn)物的功能部分。
2.2 SMV基因產(chǎn)物的功能
對(duì)SMV基因產(chǎn)物，研究最多的是外殼蛋白(CP)，其次是NIb和NIa，其它基因產(chǎn)物的功能知之甚少，在此根據(jù)Potyvirus其它成員的比較得到了一些推測(cè)性結(jié)論。
(1)5′末端蛋白：35K(P1)、HC、42K(P3)， 這幾個(gè)蛋白的功能，在SMV上研究尚少。35K、HC蛋白在基因組翻譯產(chǎn)物加工中發(fā)揮重要作用，Carringtion等(1989)證實(shí)［7,8］，在SMV多聚蛋白前體5′-末端的P1 (35K)和HC之間、HC和42K(P3)之間的酶切位點(diǎn)，分別由這二種蛋白酶識(shí)別切割，分別將其自身從多聚蛋白前體切割下來(lái)。切割的雙肽序列分別為(Y/F)′S、G′G(“′”表示酶切點(diǎn)，下同)(圖1)。Domier等(1987)［9］研究TVMV的P1蛋白認(rèn)為其與病毒粒子在寄主細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。由于35K(P1)、42K(P3)蛋白在Potyvirus中同源性很低，而同種病毒的不同株系間，具有94%同源性，所以比較該二種蛋白，也可作為Potyvirus分類的依據(jù)。他還認(rèn)為這三個(gè)蛋白還可能與寄主的抗性有關(guān)。HC蛋白與蚜蟲的傳播有關(guān)。
圖1 SMV多聚蛋白上氨基酸酶解位點(diǎn)及酶解后產(chǎn)生的各成熟蛋白
Fig.1 Cleavage site and predicated mature proteins of SMV polyprotein
酶切位點(diǎn)處雙肽序列及其基因組編碼位置分別標(biāo)于框的上方和下方 The dipeptide which cleavage occurs and their position in the genome are shown above and below the map，respectively YS:35K蛋白酶酶切位點(diǎn)the cleavage site of 35K protease; GG:HC蛋白酶酶切位點(diǎn) the cleavage site of HC protease;QS、QS、QS、ES、QG、QS——均為NIa蛋白酶酶切位點(diǎn)。其中“ES”為NIa蛋白酶的一個(gè)次級(jí)酶切位點(diǎn) All are cleavaged by NIa protease.Among them,“ES”is a late event cleavage site of NIa protease
圖2 TEV基因組結(jié)構(gòu)和多聚蛋白前體酶解加工模式
Fig.2 Genomic map of TEV and model for protease processing of
its precursor polyprotein Maria A等,1992 Maria A.et al,1992
P3(42K)蛋白在Potyvirus成員之間的同源性最差，僅為25.7%～33.0%［10］，它是否是翻譯產(chǎn)物加工的輔助因子，還是RNA復(fù)制過(guò)程中的輔助因子，或在翻譯、復(fù)制中起調(diào)控作用，尚無(wú)任何證［11］。
(2)CIP：即風(fēng)輪狀內(nèi)含體蛋白，電鏡觀察，所有馬鈴薯Y病毒組的病毒都能在寄主細(xì)胞中形成風(fēng)輪狀內(nèi)含體，這與CIP的作用有關(guān)［12］。它所形成的內(nèi)含體同原生質(zhì)膜、胞間連絲及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聯(lián)系在一起，也說(shuō)明CIP起結(jié)構(gòu)性功能，它可能改變細(xì)胞骨架適應(yīng)病毒的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)。SMV CIP由一組具解旋酶特性的蛋白質(zhì)組成保守的核苷酸結(jié)合保守區(qū)，簡(jiǎn)稱NTBM，參與病毒RNA的復(fù)制，CIP有核酸刺激的ATP酶活性，并能解開RNA螺旋，這個(gè)解旋酶活性是由3′→5′方向的［13］。RNA解旋可能是基因組復(fù)制的早期步驟，對(duì)CIP研究有助于了解RNA復(fù)制機(jī)理。
(3)6 kD蛋白：功能目前尚不太清楚，推測(cè)可能與復(fù)制有關(guān)，它可能把NIa/Vpg定置在膜上，阻止NIa蛋白核定位功能，干擾NIa的向核轉(zhuǎn)移活性。只有通過(guò)NIa自身的自我酶切活性使NIa與6KD分開，才能使NIa恢復(fù)向核轉(zhuǎn)移定位的能力。
(4)NIa蛋白：由21K(Vpg)蛋白和27K(NIa)蛋白酶兩個(gè)域組成，其N端是21K(Vpg)蛋白，其保守序列中富含芳香族氨基酸，如Tyr，Phe，并通過(guò)Tyr等殘基與基因組RNA連接，推測(cè)行使RNA復(fù)制起始或參與RNA中間體的加工的功能。NIa蛋白的C端是27K(NIa)蛋白酶，27K(NIa)蛋白酶是含有絲氨酸(Ser)的胰蛋白酶，其活性由His、Asp、Cys組成的三分體決定。在SMV中His、Asp和Cys分別在236、271和341位置。27K(NIa)蛋白酶N端的3/4區(qū)域，同源性很高，該保守區(qū)氨基酸可能導(dǎo)致蛋白的適當(dāng)折疊，以使構(gòu)成催化活性部位的重要氨基酸殘基(His、Asp、Gys)形成特定結(jié)構(gòu)域。27K(NIa)蛋白酶的C端氨基酸序列在不同Potyvirus成員之間，同源性差別很大，而SMV不同株系之間如(G2、G6、G7株系)同源性很高，這可能與27K(NIa)蛋白酶切位點(diǎn)的高度專一有關(guān)，使得具有相同酶切位點(diǎn)的各個(gè)potyvirus成員的27K(NIa)蛋白酶識(shí)別自身單一的酶切序列。27K(NIa)蛋白的胰蛋白酶活性的重要作用是對(duì)基因組的翻譯產(chǎn)物起加工作用。Ghabrial等(1990)［14］從SMV G6株系上的研究認(rèn)為，27K(NIa)蛋白酶的酶切位點(diǎn)在多聚蛋白上氨基酸序列為Q′S或Q′G的雙肽之間(圖1)。進(jìn)一步對(duì)切點(diǎn)旁側(cè)氨基酸序列進(jìn)行分析，得SMV NIa蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的七肽保守序列為：
P6 P5 P4 P3 P2 P1′ P1
Asn/Glu Xaa Val Xaa Xaa Glu Gly/ser
27K(NIa)蛋白的加工切割只同剪切點(diǎn)周圍的七肽保守序列有關(guān)，而與剪切點(diǎn)周圍的其它氨基酸無(wú)關(guān)，其對(duì)基因組翻譯產(chǎn)物的加工作用主要是酶切包括它自己在內(nèi)的五至六個(gè)保守切割點(diǎn)，涉及到整個(gè)多聚蛋白近C端2/3的區(qū)域［16］。圖1中42K/CI、CI/6K、6K/21K、27K/NIb、NIb/CP5個(gè)切點(diǎn)(QS、QS、QS、QG、QS)均由NIa蛋白酶識(shí)別切割。其中21K/27K之間的ES切割點(diǎn)是一個(gè)次級(jí)酶切位點(diǎn)，由NIa蛋白酶切割NIa蛋白內(nèi)部產(chǎn)生基因組連接蛋白21K(Vpg)和27K(NIa蛋白酶)。這個(gè)酶切位點(diǎn)的七肽保守序列(E/Q)(D/E/R)(L/V)XXE′(G/S/A)(E/K)(S/A)(L/V)與其它已知Potyvirus成員相一致。
(5)NIb蛋白：一般被認(rèn)為是一種依賴于RNA的RNA聚合酶［16］。劉俊君等(1994)［17］SMV NIb序列與WMV-Ⅱ NIb等其它Potyvirus成員比較發(fā)現(xiàn)從N端到C端含有5段高度保守多肽序列，其中序列GNNSGQPSTVVDNT(S)LMVXXA和GDD是所有動(dòng)物、植物以及細(xì)菌病毒依賴于RNA的RNA聚合酶的兩段特征性保守序列。類比性研究發(fā)現(xiàn)，GDD保守區(qū)在結(jié)構(gòu)上類似于ATP和GTP結(jié)合酶類的B保守區(qū)NTP結(jié)合位點(diǎn)，而GNNSGQPSTVVDNT類似于ATP和GTP結(jié)合酶類的A保守區(qū)，推測(cè)這二個(gè)保守區(qū)可能直接參與了酶促反應(yīng)中與底物結(jié)合的過(guò)程，是RNA復(fù)制酶活性中心和維持核酸結(jié)構(gòu)不可缺少的區(qū)域［18,19］。
(6)CP蛋白：目前對(duì)于馬鈴薯Y病毒組成員的CP蛋白(Coat protein)的結(jié)構(gòu)和功能研究得最深刻。其最基本的功能是作為結(jié)構(gòu)蛋白包被RNA。SMV CP是由265個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量為30 kD，由單一多肽鏈構(gòu)成［4］。所有potyvirus成員CP從空間結(jié)構(gòu)上看，CP的單一肽鏈折疊成三個(gè)球狀的結(jié)構(gòu)域：N端、C端和抗胰蛋白酶的核心區(qū)［20］。大量證據(jù)表明，CP的N端和C端暴露在粒體表面，用胰蛋白酶溫和處理，可以水解CP的N端30個(gè)及C端約18～20個(gè)氨基酸的肽段［21,22］。留下的核心仍形態(tài)完整。每個(gè)CP這樣的空間結(jié)作為一個(gè)亞基，由大約2 000個(gè)CP亞基包括病毒基因組RNA，裝配成一個(gè)病毒粒體［20］。Ward等(1991)認(rèn)為CP亞基暴露的N端區(qū)域有很大的差異，說(shuō)明它參與了病毒特異的作用或寄主，介體，病毒的相互作用［23］。CP編碼有寄主決定因素，主要涉及寄主，介體、病毒的相互作用，例如可以影響寄主范圍和癥狀誘導(dǎo)［22］。在蚜傳的病毒CP蛋白N端存在一個(gè)特殊保守的(I/V)DAG塊［24,25］，Atreya等(1990)用全長(zhǎng)TVMV cDNA克隆單一改變VDAG為VDAE產(chǎn)生了一個(gè)非蚜傳株，已經(jīng)發(fā)表的SMV-N(非蚜傳株系)的CP缺少DAG序列。說(shuō)明DAG塊和N端其它氨基酸對(duì)蚜傳有相關(guān)性［26］。現(xiàn)將SMV基因產(chǎn)物的功能列表(見表3)。
表3 SMV基因產(chǎn)物功能
Table 3 Functions of SMV gene products
基因產(chǎn)物
Gene products 氨基酸序列特征
Character of amino acid sequence 功能
Function
35K(P1)P 絲氨酸型蛋白酶? 蛋白酶解，細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)、寄主抗性
HC-Pro 半胱氨酸型蛋白酶? 蛋白酶解、蚜傳、寄主抗性
42K(P3) 翻譯產(chǎn)物加工?(輔助因子)
ⅡCI 具保守序列GAVGSGKST，為核苷酸結(jié)合保守區(qū)復(fù)制(解旋)，細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)?
6K 復(fù)制?阻止NIa核定位
21K(Vpg) 富含芳香族氨基酸 復(fù)制起始等
NIa 絲氨酸型蛋白酶，由His、Asp、Cys構(gòu)成催化活性區(qū)域 蛋白酶解多聚蛋白近C端的五至六個(gè)保守切割點(diǎn)
NIb 含依賴于RNA的RNA復(fù)制酶的保守區(qū)域，如(GDD)等 復(fù)制、促進(jìn)酶與底物的結(jié)合等
CP 單一肽鏈折疊成三個(gè)球狀結(jié)構(gòu)域,N端,C端,核心區(qū),蚜傳株系有DAG塊 蚜傳，RNA包裝、寄主范圍，癥狀誘導(dǎo)
3 關(guān)于SMV分子生物學(xué)研究中的一些問(wèn)題
我們知道，SMV只侵染5個(gè)科的植物，寄主范圍非常窄，而西瓜花葉病毒(WMV-Ⅱ)可侵染22個(gè)科的植物，寄主范圍較寬，即二種病毒寄主范圍不同，很難斷定他們是一種病毒或近緣的?？墒?，根據(jù)CP基因、NIb基因、3′-NTR區(qū)域的核苷酸序列比較，得出完全相反的結(jié)論。劉俊君根據(jù)RdRp很可能是生命起源過(guò)程中最早形成的酶類之一的觀點(diǎn)，認(rèn)為NIb可能是病毒分子分類學(xué)的最好尺度。在potyvirus不同成員之間，NIb蛋白具有相對(duì)保守性，不同成員之間氨基酸同源性在52.7%～60.9%，同種病毒不同株系之間核苷酸同源性為82.7%～83.1%，氨基酸同源性94.6%～95.6%。SMV-BJ和WMV-Ⅱ(USA)NIb的氨基酸比較；同源性可達(dá)91.3%，核苷酸同源性80.3%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不同成員之間的同源性，所以綜合比較SMV-BJ的3′-NTR區(qū)域，CP基因，和NIb基因與WMV-Ⅱ之間的同源性，認(rèn)為WMV-Ⅱ是SMV的一個(gè)西瓜株系。更精確的分類關(guān)系有待于兩種病毒的生物學(xué)和分子生物學(xué)的進(jìn)一步研究結(jié)果。
王升吉:男，35歲，碩士研究生，助理研究員
王升吉等： 大豆花葉病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展
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收稿日期：1997-10-30 第 3 期
Advances of Research on Molecular Biology of
Soybean Mosaic Virus
Wang Shengji1 Wu Yuanhua2
(1 Institute of Plant Protection,Shandong Acad of Agric Sci,Jinan 250100;
2 Department of Plant Protection,Shenyang Agric Univ , Shenyang 110161)
Abstract: The soybean mosaic virus(SMV)has a genome consisting of a single-stranded positive-sense RNA,similar to those of other potyvirus.It is composed of approximately 10 000 nucleotides long with a coding capacity for a precursor polyprotein.By the processing of protease cleavage,nine mature proteins are formed:35K(P1)、HC、42K(P3)、CIP、6K、21K(Vpg)、27K(NIa)、NIb and CP.Three virus-encoded protease participate in the processing of precursor polyprotein,they are 35K(P1)、HC and NIa protease.All mature protein generated from protease processing have important functions in the whole viral living cycle,including that polymerase、translation、and processing,etc.
Key words: soybean mosaic virus; polyprotein; protease
