病毒感染有可能導(dǎo)致癌細(xì)胞生長？致癌基因是如何被發(fā)現(xiàn)的？
洛克菲勒大學(xué)的Founder's Hall source：wikipedia
1911年，洛克菲勒醫(yī)學(xué)研究所（洛克菲勒大學(xué)前身）的裴頓．勞斯（Peyton Rous）教授發(fā)表了一篇論文，帶給了生醫(yī)界一個新的想法：
病毒感染有可能導(dǎo)致癌細(xì)胞生長。
根據(jù)論文的實(shí)驗(yàn)方法，勞斯教授取出了母雞的乳癌細(xì)胞，并經(jīng)研磨、離心和過慮后，將濾液注入健康的母雞體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)的母雞有很高的比例都誘發(fā)癌細(xì)胞的生長；又因?yàn)閷?shí)驗(yàn)使用過濾器材的孔徑比細(xì)菌還小，所以癌癥的誘發(fā)可能是經(jīng)由濾過性病毒傳染。
裴頓．勞斯（Peyton Rous）教授。圖／wikimedia commons
但勞斯教授的論文當(dāng)時并沒有立即在學(xué)界引起廣大的回響，一直要到1960 年代，科學(xué)家才終于發(fā)現(xiàn)和鼠類乳癌與白血?。ㄑ┫⑾⑾嚓P(guān)的RNA 病毒。特定品系的實(shí)驗(yàn)鼠有很高的比例會罹患相同的癌癥，而且還能在電子顯微鏡中觀察到RNA 病毒從癌細(xì)胞表面出芽生長；很顯然的，這種RNA 病毒會經(jīng)由垂直傳染，而致癌因子在不妨礙細(xì)胞基本機(jī)能的情況下由親代傳給子代，如此造就了高比例的同品系實(shí)驗(yàn)鼠產(chǎn)生相同的癌癥。
但究竟癌癥傳染的機(jī)制為何？致癌的機(jī)轉(zhuǎn)又是怎么一回事？是否了解了致癌的病毒就可以一勞永逸地治療癌癥？本文將帶領(lǐng)讀者看看科學(xué)家們是如何一步一步的回答這些問題。
反轉(zhuǎn)錄病毒的發(fā)現(xiàn)
既然先前觀察到從癌細(xì)胞表面出芽生長的是以RNA 為遺傳因子的病毒，很直觀的就會認(rèn)定造成垂直遺傳的致癌因子就是該病毒的RNA，但科學(xué)家發(fā)現(xiàn)這種RNA 病毒的生活史當(dāng)中存在著合成的病毒DNA，那么致癌的因子到底是病毒的RNA 還是DNA，就需要進(jìn)一步的驗(yàn)證了。
霍華德．特明（Howard Temin）教授。圖／BY Associated Press@wikimedia commons
威斯康辛大學(xué)的霍華德．特明（Howard Temin）教授提出了一個可能：
這種RNA 病毒會先以RNA 為模板合成互補(bǔ)的DNA 序列
合成的病毒DNA 會嵌入宿主的DNA 中
嵌入后的病毒DNA 成為RNA 合成的模板并進(jìn)行病毒復(fù)制
雖然看起來合理，但這樣的假說在當(dāng)時面臨一個很大的問題：「以RNA作為模板合成DNA 」在整個生物界中是前所未聞，也和弗朗西斯．克里克（Francis Crick）所提出的細(xì)胞中心假說（central dogma／遺傳訊息是由DNA到RNA到蛋白質(zhì)）相違背，更重要的是具有「以RNA為模板的DNA合成酶」從來就沒有被發(fā)現(xiàn)過！
但就在1970年，麻省理工學(xué)院的戴維．巴爾的摩（David Baltimore）教授發(fā)現(xiàn)了催化「以RNA作為模板合成DNA 」的酵素。
巴爾的摩教授選擇鼠類白血球增生性腫瘤病毒（Rauscher mouse leukemia virus／R-MLV）與勞斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus／RSV）兩種RNA 病毒來做實(shí)驗(yàn)，他將病毒株純化并加入鎂離子、氯化鈉、二硫蘇糖醇（dithiothreitol／可避免酵素中的硫醇根氧化）和去氧核苷三磷酸（dNTP／其中dTTP有做放射線標(biāo)定）創(chuàng)造出有利于DNA 合成的培養(yǎng)環(huán)境，結(jié)果產(chǎn)生了分子量大且具有放射性的DNA 產(chǎn)物。
戴維．巴爾的摩（David Baltimore）教授發(fā)現(xiàn)了催化「以RNA作為模板合成DNA 」的酵素。圖／wikimedia commons
為了證實(shí)該DNA的合成是源自于病毒的RNA，巴爾的摩教授又更進(jìn)一步做了兩組對照的實(shí)驗(yàn)：
※已知僅RNA 會被胰核糖胰核酸酶（pancreatic ribonuclease）破壞，DNA 則否
1-1一般病毒培養(yǎng)進(jìn)行DNA 合成做為實(shí)驗(yàn)對照組
1-2病毒培養(yǎng)的環(huán)境中加入胰核糖核酸酶
2-1靜置純化過的病毒株20 分鐘再進(jìn)行DNA合成反應(yīng)
2-2預(yù)先用胰核糖核酸酶處理純化的病毒20 分鐘再進(jìn)行DNA合成反應(yīng)
經(jīng)過與對照組1-1 產(chǎn)率的比較后發(fā)現(xiàn)，1-2 在加入胰核糖核酸酶會使得DNA 產(chǎn)物下降，2-2 預(yù)先用胰核糖核酸酶處理的病毒株其DNA 產(chǎn)率更低，2 -1 單純靜置20 分鐘后則還有相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)率。
此實(shí)驗(yàn)結(jié)果證成了「以RNA作為模板合成DNA 」的假說，而這種僅在特殊RNA病毒上發(fā)現(xiàn)的「以RNA為模板的DNA合成酶」后來被稱作反轉(zhuǎn)錄酶；反轉(zhuǎn)錄病毒在將RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA后，病毒的DNA會嵌入宿主的DNA，經(jīng)由轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯合成病毒的蛋白質(zhì)，使得宿主細(xì)胞病變（例如癌化），也因?yàn)椴《編в械闹掳┗蛟诟腥竞笠殉蔀樗拗鱀NA的一部份，所以當(dāng)生殖細(xì)胞也受到病毒感染時，減數(shù)分裂后的配子也就理所當(dāng)然的帶有病毒的致癌基因，造成癌癥的垂直傳染。
Src 基因的發(fā)現(xiàn)
了解了病毒如何將致癌基因帶給宿主后，科學(xué)家的下一個目標(biāo)就是要研究到底反轉(zhuǎn)錄病毒中的哪一段基因具有致癌性。1970年代，某些突變后的致癌性反轉(zhuǎn)錄病毒被發(fā)現(xiàn)，這種突變的反轉(zhuǎn)錄病毒雖然可以感染宿主，卻沒有致癌能力，顯示致癌與否的關(guān)鍵就存在于變種與原病毒株之間的基因體差異。
加州大學(xué)舊金山分校的哈羅德．瓦慕斯（Harold Varmus）、米高．畢曉普（J.Michael Bishop）和多明尼克．施特赫林（Dominique Stehelin）教授設(shè)計(jì)了以下的實(shí)驗(yàn)，用鳥類白血病性肉瘤性病毒（avian leukosis-sarcoma virus）找出了一種致癌基因src（命名由來為肉瘤sarcoma）：
分離出基因突變后不具致癌性的反轉(zhuǎn)錄病毒并取其RNA，經(jīng)基因分析和比對，發(fā)現(xiàn)其亡失了10-20%的基因體。
取出原病毒株的完整RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成單股的互補(bǔ)DNA（cDNA），并用放射線標(biāo)定DNA產(chǎn)物。
將突變病毒的RNA 與具有放射性的cDNA 進(jìn)行堿基配對，沒有RNA 配對的cDNA 為突變病毒亡失的基因體，含有致癌基因。
用管柱層析法分離出帶有致癌基因的cDNA，并命名為cDNA src。
從病毒中找到cDNA src 之后，科學(xué)家又有了新的發(fā)現(xiàn)：原來在許多種健康的鳥類（包括：雞、火雞、鵪鶉、鴨和鴯鹋）細(xì)胞當(dāng)中也可以找到和cDNA src 堿基互補(bǔ)的DNA序列，這表示反轉(zhuǎn)錄病毒所帶的致癌基因，很有可能是鳥類原有的DNA序列，只是在反轉(zhuǎn)錄病毒的生活史中，和嵌入的病毒DNA一同被轉(zhuǎn)錄，并且成為新的病毒基因體的一部分，而帶有src基因的病毒在感染后可以促使宿主細(xì)胞大量分裂（癌化）所以在演化過程中被保留了下來。
許多種健康的鳥類（包括：雞、火雞、鵪鶉、鴨和鴯鹋）細(xì)胞當(dāng)中也可以找到和cDNA src 堿基互補(bǔ)的DNA序列。圖／pixabay
但更驚人的還在后頭，科學(xué)家接著發(fā)現(xiàn)源來不只是鳥類，所有脊索動物門的動物細(xì)胞內(nèi)都能找到和cDNA src 互補(bǔ)的DNA序列！既然src基因存在于所有的脊索動物，則其必然具備某種重要的細(xì)胞生理機(jī)能。所以科學(xué)家接著所要解決的問題是：
Src 基因所轉(zhuǎn)譯的蛋白質(zhì)具有什么細(xì)胞機(jī)能？
嵌入病毒src基因（v-src）后的宿主細(xì)胞究竟產(chǎn)生了怎樣的病變？
Src基因的細(xì)胞生理機(jī)能
科羅拉多大學(xué)的雷蒙．艾瑞克森（Raymond Erikson）教授率先找出src 基因的功能。
他從感染勞斯肉瘤病毒（RSV）的實(shí)驗(yàn)動物中萃取出專一的抗體，并使用免疫沉淀法分離出src基因轉(zhuǎn)譯出的蛋白質(zhì)，經(jīng)過分析，這種蛋白質(zhì)的分子量約為60,000道爾頓，故稱之為pp60 src ；又將受感染的動物細(xì)胞進(jìn)行固定和組織切片后，再用鐵蛋白（ferritin）標(biāo)定與pp60 src 結(jié)合的抗體，發(fā)現(xiàn)pp60 src 皆附著于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)面，尤其集中在細(xì)胞的隙型連結(jié)（gap junction）。
艾瑞克森教授接著將pp60 src 與抗體的復(fù)合物加入含有[ 32 P]ATP的培養(yǎng)液中，放置一段時間后，發(fā)現(xiàn)ATP上帶有放射性的磷酸根被轉(zhuǎn)移到與pp60 src 復(fù)合的抗體的重鏈（heavy chain）上，顯然pp60 src 具有催化蛋白質(zhì)磷酸化的功能，而這也是科學(xué)家第一次了解到致癌基因的致病機(jī)轉(zhuǎn)：
細(xì)胞生理的控制很大一部分倚靠著蛋白質(zhì)的磷酸化／去磷酸化，如pp60 src 在接受到細(xì)胞外的分子訊息后活化，磷酸化下游蛋白質(zhì)，下游蛋白質(zhì)再進(jìn)行一連串的訊息傳遞與放大，最后活化轉(zhuǎn)錄因子，產(chǎn)生蛋白質(zhì)并改變細(xì)胞生理狀態(tài)；當(dāng)磷酸化／去磷酸化沒有受到精準(zhǔn)的調(diào)控，細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的代謝途徑就會受到影響，若其中牽涉到細(xì)胞生長的訊息傳遞途徑，就可能造成細(xì)胞不正常的增生，也就是細(xì)胞的癌化。
Src基因的磷酸化功能雖有重要的生理意義，但在之前學(xué)界中都沒有被發(fā)現(xiàn)，這是因?yàn)椴煌谝话愕牧姿峄退貢饔迷诘鞍踪|(zhì)序列中的絲胺酸（Serine）和蘇胺酸（Threonine）上，pp60 src 則是將磷酸根轉(zhuǎn)移到酪胺酸（Tyrosine）上，而細(xì)胞中磷酸化絲胺酸（phosphorylated serine）和磷酸化蘇胺酸（phosphorylated threonine）的數(shù)量大概是磷酸化酪胺酸（phosphorylated tyrosine）的3,000倍，所以早期并沒有發(fā)現(xiàn)酪胺酸磷酸酶的存在。
經(jīng)過比較后發(fā)現(xiàn)，受到勞斯肉瘤病毒感染的動物其癌細(xì)胞內(nèi)磷酸化酪胺酸的數(shù)量約為一般動物細(xì)胞的8 倍，是v-src 的高度磷酸化表現(xiàn)造就了宿主細(xì)胞的不正常增生。
核苷酸序列的改變―另一種致癌的機(jī)制
圖／wikimedia commons
正當(dāng)科學(xué)家們高興找到的src 的致癌機(jī)轉(zhuǎn)，以為克服了癌癥的難關(guān)，麻省理工學(xué)院的羅伯特．溫伯格（Robert Weinberg）教授提出另一種不同于病毒感染的致癌機(jī)制：
核苷酸序列的改變會活化致癌基因并造成細(xì)胞癌化。
其實(shí)驗(yàn)過程簡單整理如下：
用3-MC、BP 等致癌化學(xué)物使得實(shí)驗(yàn)鼠細(xì)胞癌化，產(chǎn)生15種不同的細(xì)胞株（cell line）
萃取出不同細(xì)胞株的DNA 并轉(zhuǎn)染纖維母細(xì)胞（fibroblast／NIH3T3）
觀察轉(zhuǎn)染后的NIH3T3 是否有癌化的征兆，產(chǎn)生凝塊（clump）
萃取一般動物細(xì)胞DNA 作為對照組，轉(zhuǎn)染NIH3T3 觀察是否造成細(xì)胞癌化
結(jié)果在15 種細(xì)胞株當(dāng)中，有5 種萃取出的DNA 在轉(zhuǎn)染后會造成NIH3T3 的癌化，而一般動物細(xì)胞則沒有造成癌化的能力，顯然一開始的化學(xué)分子操作改變了細(xì)胞的DNA序列，并使之擁有造成其他細(xì)胞癌化的能力：
病毒感染不再是唯一的致癌途徑。
在1981 年，科學(xué)家改采用人類的癌細(xì)胞進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，在26 種膀胱癌（bladder carcinoma）細(xì)胞株當(dāng)中，有兩種萃取出的DNA（EJ和J82）具有使細(xì)胞癌化的能力，再經(jīng)過一番研究，EJ 和J82 的細(xì)胞株當(dāng)中并不含病毒嵌入的DNA 序列，可見人類本身的DNA當(dāng)中就存有某種致癌基因，當(dāng)該基因被（不正常）活化的時候，便會造成細(xì)胞的癌化。
于是科學(xué)家的目光開始聚焦在找出人類DNA 序列中的致癌基因，很快的在1982 年就從EJ 和J82 中分離出具有致癌能力的DNA 片段，而經(jīng)過DNA 比對，該序列和哈威肉瘤病毒（Harvey sarcoma virus）所帶有的致癌基因（ras）基本上是一致的（儀器檢測不出差異）；科學(xué)家便推測：
人類的ras 基因在某種機(jī)制的活化（突變）后，或許和哈威肉瘤病毒造成的癌化有相同的致病機(jī)轉(zhuǎn)。
在同年年底，科學(xué)家分析膀胱癌細(xì)胞突變后的ras基因的核苷酸序列后發(fā)現(xiàn)，ras 的突變僅僅是由于單一的堿基置換：
序列中有固定一個鳥嘌呤（Guanine）被換成了胸腺嘧啶（Thymidine），而該點(diǎn)突變改變了密碼子的遺傳訊息，使得原本ras 蛋白質(zhì)上的甘胺酸（Glycine）被纈胺酸（Valine ）取代。
這又與哈威肉瘤病毒所帶有的ras 基因有相同的特征：
受病毒感染的細(xì)胞轉(zhuǎn)譯出的ras 蛋白質(zhì)當(dāng)中的同樣一個甘胺酸，被精胺酸（Arginine）取代，顯然此甘胺酸對于ras 蛋白質(zhì)的構(gòu)形與功能有重大的影響。
更有什者，由于哈威肉瘤病毒感染后會導(dǎo)致鼠類的肉瘤（sarcoma／癌細(xì)胞起源于軟組織）與白血?。╨eukemia／癌細(xì)胞起源于骨髓），與膀胱癌（carcinoma／癌細(xì)胞起源于上皮組織）的癌癥分類并不同，這是因?yàn)閞as 屬于小分子量GTP 水解酶（small GTPase／ small G protein），調(diào)控著細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)訊息活化，所以當(dāng)ras 被大量轉(zhuǎn)譯容易造成細(xì)胞癌化，而ras也是科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)會造成不同種類癌癥的單一基因突變。
為了攻克癌癥這個難題
圖／pixabay
為了攻克癌癥這個難解的疾病，科學(xué)家們從癌癥的起源著手，發(fā)現(xiàn)了有致癌性的反轉(zhuǎn)錄病毒，之后又了解到許多致癌基因本來就存在于人類的DNA，像src 和ras，所以又將它們稱做原致癌基因（proto-oncogene），當(dāng)不正常表現(xiàn)時會造成細(xì)胞的癌化。
但癌癥的發(fā)生機(jī)轉(zhuǎn)非常復(fù)雜，每當(dāng)科學(xué)家找出一種致癌途徑卻總發(fā)現(xiàn)沒能窮盡所有可能，于是即使研究向前了一步也不得停下追尋答案的腳步，也是在研究癌癥的過程中，漸漸拼湊出細(xì)胞內(nèi)各種訊息活化的途徑，當(dāng)我們現(xiàn)在看著一張張清楚的細(xì)胞機(jī)制圖時，可別忘了科學(xué)家們努力不懈的斑斑足跡啊！
翻譯并改寫自 Cell Biology, Gerald Karp 7 th edition P.694-697 The Discovery of Oncogenes
本篇文章已取得授權(quán)編譯，若有疑慮或是希望取得授權(quán)請聯(lián)絡(luò)Wiley Press。
本書亦有中文版本：細(xì)胞生物學(xué)-結(jié)合了理論與實(shí)驗(yàn),帶您一窺生命的奈米世界，合記圖書出版社。
