摘要： 接二連三的個(gè)人基因組圖譜繪制陸續(xù)完成，說明了第二代測(cè)序技術(shù)的強(qiáng)大力量，但是第二代測(cè)序技術(shù)很快就遇上了強(qiáng)勁的對(duì)手——第三代測(cè)序技術(shù)，也就是被稱為下下一代的測(cè)序（next-next-generation sequencing）的直接測(cè)序方法。 | |
生物通報(bào)道：接二連三的個(gè)人基因組圖譜繪制陸續(xù)完成，說明了第二代測(cè)序技術(shù)的強(qiáng)大力量，但是第二代測(cè)序技術(shù)很快就遇上了強(qiáng)勁的對(duì)手——第三代測(cè)序技術(shù)，也就是被稱為下下一代的測(cè)序（next-next-generation sequencing）的直接測(cè)序方法。這一測(cè)序技術(shù)是基于納米孔（nanopore）的單分子讀取技術(shù)，不同于之前的兩代技術(shù)（需要熒光或者化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的協(xié)助下, 通過讀取DNA聚合酶或DNA連接酶將堿基連接到DNA鏈上過程中釋放出的光學(xué)信號(hào)而間接確定的），可以直接讀取序列信息，簡潔快速。 第一代測(cè)序技術(shù)是雙脫氧鏈末端終止法——根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，產(chǎn)生A，T，C，G四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得DNA序列。第二代測(cè)序技術(shù)是焦磷酸測(cè)序法——由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，適于對(duì)已知的短序列的測(cè)序分析。而第三代測(cè)序技術(shù)則是基于納米孔的單分子讀取技術(shù)，這種方法讀取數(shù)據(jù)更快、有望大大降低測(cè)序成本，改變個(gè)人醫(yī)療的前景。這一技術(shù)的研發(fā)是系統(tǒng)工程，涉及生物、半導(dǎo)體、計(jì)算機(jī)、化學(xué)、光學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，需要不同學(xué)科頂尖力量的合作。
雖然目前已知第三代測(cè)序技術(shù)的基本原理是在納米孔中配置納米電極，用電測(cè)方法測(cè)量一個(gè)DNA的核酸堿基排列。但是電測(cè)識(shí)別一個(gè)分子的技術(shù)開發(fā)極其困難，因此尚未有驗(yàn)證該原理的實(shí)例。 近期來自日本大阪大學(xué)產(chǎn)業(yè)科學(xué)研究所納米技術(shù)中心的研究人員利用大約只有1納米的超短距離的電極，成功地測(cè)量出構(gòu)成DNA的1個(gè)核酸堿基分子中流動(dòng)的電流。這種電測(cè)方法是下一代DNA測(cè)序基本原理在世界上首次驗(yàn)證成功。這一研究成果公布在《Nature Nanotechnology》雜志上。 領(lǐng)導(dǎo)這一研究的是大阪大學(xué)的Kazumichi Yokota博士和Tomoji Kawai研究員，這項(xiàng)研究是科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)實(shí)施的“戰(zhàn)略創(chuàng)造研究推進(jìn)事業(yè)”中的個(gè)人型研究課題《自我組織化線路的超高集成分子設(shè)備的創(chuàng)制》的一部分。 DNA測(cè)序在個(gè)人醫(yī)療、精確搜查罪犯、超高速檢驗(yàn)病毒等領(lǐng)域起著巨大作用，然而目前的兩代測(cè)序方法，測(cè)序序列都是在熒光或者化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的協(xié)助下，通過讀取DNA聚合酶或DNA連接酶將堿基連接到DNA鏈上過程中釋放出的光學(xué)信號(hào)而間接確定的，除了需要昂貴的光學(xué)監(jiān)測(cè)系統(tǒng), 還要記錄、存儲(chǔ)并分析大量的光學(xué)圖像，這都使儀器的復(fù)雜性和成本增加，依賴生物化學(xué)反應(yīng)讀取堿基序列更增加了試劑、耗材的使用。 要獲得更加迅速、高精度的檢驗(yàn)，就需要開發(fā)超高速低成本的DNA測(cè)序方法，第三代測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，納米孔技術(shù)不需要熒光標(biāo)記物并且很可能不需要進(jìn)行擴(kuò)增，能直接并快速“讀”出DNA，同時(shí)足夠廉價(jià)，使進(jìn)行大量重復(fù)實(shí)驗(yàn)成為可能。目前一些公司已經(jīng)研發(fā)出包含幾百個(gè)納米孔的芯片，可以用在一臺(tái)機(jī)器上，快速且廉價(jià)地給大量DNA進(jìn)行排序。比如去年Complete Genomics公司就公布了三個(gè)利用這一技術(shù)完成的基因組測(cè)序（具體見專訪Radoje Drmanac：5000元測(cè)序的奧秘）。 在這篇文章中，研究人員利用納米加工技術(shù)制作電極間距為1納米的電極，這種方法能在納米電極間以0.01納米的精度進(jìn)行控制。隨后將核酸堿基的一個(gè)分子夾在電極之間，通電后經(jīng)過測(cè)定發(fā)現(xiàn)有三個(gè)核酸堿基分子顯示異常電流值，證明通過電測(cè)可識(shí)別一個(gè)分子單位的核酸堿基分子種類。這種電測(cè)方法是下一代DNA測(cè)序基本原理在世界上首次驗(yàn)證成功。 納米孔就是直徑在納米尺度的小孔(1－2 nm)，通常是利用固態(tài)物質(zhì)或者生物分子制成的小孔，這種想法是在電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下，當(dāng)線狀DNA分子通過小孔時(shí)，通過一些物理手段來確定堿基的序列。但是這種技術(shù)也有以些關(guān)鍵問題需要解決，比如區(qū)分4種核苷酸的速度要與DNA運(yùn)動(dòng)的速度相稱；控制DNA通過納米孔的速度。 計(jì)算和實(shí)驗(yàn)表明, 僅僅測(cè)量通過納米孔離子電導(dǎo)率是不可能提供識(shí)別DNA分子中每個(gè)核苷酸所需要的分辨率，納米孔通道長度通常為5nm, 可以容納十多個(gè)堿基, 這一尺寸對(duì)于測(cè)序所需要的分辨單個(gè)堿基引起的電流變化過長，盡管離子電流測(cè)量還不能區(qū)分單個(gè)堿基, 但其可以很容易地辨別單鏈與雙鏈DNA。 NABsys公司與 Brown大學(xué)的一個(gè)團(tuán)隊(duì)合作, 利用這一性能來開發(fā)一種雜交測(cè)序法——雜交輔助的納米孔測(cè)序方法(hybridization assisted nanopore sequencing, HANS)，將基因組 DNA 隨機(jī)切割成大約100 kb左右的片段，制成單鏈并與六寡聚核苷酸探針雜交，然后驅(qū)動(dòng)結(jié)合了探針的基因組文庫片段通過可尋址的納米孔陣列，通過每個(gè)孔的離子電流均可獨(dú)立測(cè)量，追蹤電流的變化確定探針雜交在每個(gè)基因組片段上的精確位置，利用基因組片段上雜交探針的重疊區(qū)域?qū)⒒蚪M片段文庫排列起來, 建立一組完整的基因組探針圖，利用計(jì)算機(jī)算法, 獲得完整的基因組序列。 Complete Genomics公司的技術(shù)則采用了復(fù)合探針-錨定分子連接（Combinatorial probe anchor ligation，cPAL）化學(xué)試劑，以及預(yù)制基因組DNA納米芯片，后者能提高成像效率，降低成本。具體而言：1）預(yù)制（準(zhǔn)確的框架）基因組DNA納米芯片縮小了所需試劑容量，并且能加快成像——每次成像能捕捉到更多的DNA點(diǎn)；2）新穎的試劑（復(fù)合探針-錨定分子連接）能對(duì)70個(gè)DNA堿基對(duì)進(jìn)行單獨(dú)序列閱讀——每個(gè)堿基對(duì)的閱讀都是完全獨(dú)立的，這種序列閱讀利用的是低濃度低成本試劑。測(cè)序技術(shù)步驟（見下圖）包括：1.樣品準(zhǔn)備和文庫構(gòu)建；2.DNA芯片分析；3.成像，組裝和分析；4.復(fù)合探針-錨定分子連接（Combinatorial probe -- anchor ligation，cPAL）。  下一代DNA測(cè)序技術(shù)也許能獲得飛躍性的發(fā)展，改變電極間距離從納米至微米變化，可對(duì)病毒及過敏原等各種尺寸的分子粒子進(jìn)行超高感度、超高速度檢測(cè)。當(dāng)然目前第三代基因測(cè)序技術(shù)競(jìng)爭也很激烈，美國宣稱要在2012年推出成熟的第三代基因測(cè)序儀，日本和歐洲也有相關(guān)的研發(fā)計(jì)劃。我國也有這方面的計(jì)劃，中科院北京基因組研究所是國內(nèi)權(quán)威的基因組學(xué)研究機(jī)構(gòu)，他們已和浪潮集團(tuán)成立了“中科院北京基因組研究所—浪潮基因組科學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室”，這一實(shí)驗(yàn)室將研發(fā)國產(chǎn)第三代基因測(cè)序儀，第一臺(tái)樣機(jī)預(yù)計(jì)2013年問世。 （生物通：萬紋） 參考文獻(xiàn)： 1.Identifying single nucleotides by tunnelling current，Nature Nanotechnology，Published online: 21 March 2010 | doi:10.1038/nnano.2010.42
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