背景介紹

肥胖作為糖尿病、心血管疾病和癌癥等多種慢性代謝疾病的重要誘因，是當(dāng)今世界面臨的主要健康挑戰(zhàn)之一。人類的脂肪組織主要通過脂肪細(xì)胞的肥大而擴(kuò)張，脂肪細(xì)胞體積的增加與身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）和循環(huán)胰島素水平密切相關(guān)；且脂肪細(xì)胞周期進(jìn)展與肥胖和高胰島素血癥相關(guān)。

人體中多種類型的細(xì)胞都可以通過核內(nèi)復(fù)制來適應(yīng)細(xì)胞體積的大幅增加。在核內(nèi)復(fù)制過程中，完全分化的細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，合成DNA但不進(jìn)行分裂，導(dǎo)致大的細(xì)胞DNA含量、核大小與核數(shù)量增加。然而人類脂肪細(xì)胞是否存在這樣的機(jī)制目前尚不清楚。人脂肪細(xì)胞的體積在其整個(gè)生命周期中可以增加200倍以上，那么，脂肪細(xì)胞如何適應(yīng)如此巨大的體積變化呢？有研究表明，脂肪組織的擴(kuò)張是由于脂肪細(xì)胞祖細(xì)胞（間充質(zhì)干細(xì)胞）分化和成熟脂肪細(xì)胞大小的增加。然而，通常認(rèn)為成熟的脂肪細(xì)胞無法分裂，不能進(jìn)入細(xì)胞周期（細(xì)胞周期：從一次細(xì)胞分裂完成時(shí)開始到下一次細(xì)胞分裂完成時(shí)為止所經(jīng)歷的過程。在這一過程中，細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制并均等地分配給兩個(gè)子細(xì)胞），僅通過數(shù)百倍增大自身體積，來適應(yīng)脂肪組織的擴(kuò)張。

促炎性脂肪細(xì)胞分泌模式在肥胖時(shí)增強(qiáng)，且在大的脂肪細(xì)胞中尤為明顯；然而，脂肪細(xì)胞肥大和促炎分泌的潛在機(jī)制仍不明確。早衰是一種可以誘發(fā)促炎分泌模式的細(xì)胞程序。與年齡誘導(dǎo)的衰老相反，由應(yīng)激刺激(如有絲分裂原、DNA損傷或線粒體功能障礙等)引起的早衰，正迅速成為許多慢性疾病背后的病理機(jī)制之一。同時(shí)，肥胖和糖尿病通過誘導(dǎo)高血糖水平和氧化低密度脂蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞過早衰老而加速衰老。

由于先前普遍認(rèn)為，脂肪細(xì)胞是有絲分裂后的細(xì)胞，使得脂肪細(xì)胞在衰老誘導(dǎo)的病理?xiàng)l件下的影響往往被忽視。近期一篇發(fā)表在Nature Medicine上題為“Obesity andhyperinsulinemia drive adipocytes to activate a cell cycle program and senesce”的文章，證明了成熟的人類脂肪細(xì)胞可以激活細(xì)胞周期程序，并重新定義了一種成熟的人類脂肪細(xì)胞的衰老機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)在成熟的人類脂肪細(xì)胞中具有一個(gè)意想不到的、活躍的細(xì)胞周期程序，對其進(jìn)行持續(xù)的促有絲分裂刺激(如慢性高胰島素血癥)可以導(dǎo)致促炎性衰老表型。使用二甲雙胍可抑制皮下脂肪組織中衰老的誘導(dǎo)。

敲黑板啦！

1、成熟的人類脂肪細(xì)胞可以激活細(xì)胞周期程序；

2、體外胰島素治療促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，引起細(xì)胞核大小和DNA含量增加；

3、衰老的脂肪細(xì)胞高表達(dá)CCND1，并在高胰島素血癥肥胖個(gè)體中不斷積累；

4、二甲雙胍可抑制上游有絲分裂信號傳導(dǎo)，抑制皮下脂肪組織中衰老的誘導(dǎo)。

 研究結(jié)果

 

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成熟的人類脂肪細(xì)胞可以激活細(xì)胞周期程序

為了研究人類脂肪細(xì)胞中與肥胖和高胰島素血癥相關(guān)的細(xì)胞周期程序，作者從13名受試者中分離出成熟的皮下腹部脂肪細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq（圖1a）。根據(jù)受試者的代謝特征，將測序的脂肪細(xì)胞樣本分為三組：瘦個(gè)體（lean）、正常胰島素血癥肥胖個(gè)體（OB/NI）和高胰島素血癥肥胖個(gè)體（OB/HI；C 肽水平≥1.2nM）。其中，受試者C肽水平（衡量胰島素水平的指標(biāo)）和全身胰島素抵抗程度顯著相關(guān)(圖S1f)。通過對DEGs（differentially expressed genes，差異表達(dá)基因）進(jìn)行無監(jiān)督聚類分析來表征上述測序樣本（圖1b，圖S1g，圖S2）。在OB/HI受試者中發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞周期的進(jìn)入和進(jìn)展相關(guān)的基因，而這些基因在先前的細(xì)胞生物學(xué)研究中并未涉及（圖1c和圖S2）。

圖1.成熟的人類脂肪細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄譜

細(xì)胞周期

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成時(shí)開始到下一次分裂完成時(shí)為止。絕大多數(shù)真核細(xì)胞的細(xì)胞周期分為間期與分裂期兩個(gè)階段，其中間期又細(xì)分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。細(xì)胞周期存在檢驗(yàn)點(diǎn)，只有當(dāng)內(nèi)外條件合適的時(shí)候，才能夠進(jìn)入下一個(gè)時(shí)期，完成有絲分裂，而當(dāng)條件不合適時(shí)，則會發(fā)生阻滯，即停留在細(xì)胞周期的某個(gè)時(shí)期。G1期也被稱之為第一間隔期，是細(xì)胞周期的第一階段，主要合成生長所需的蛋白質(zhì)、糖類和RNA等，但不合成DNA，其特點(diǎn)是物質(zhì)代謝活躍，合成迅速，細(xì)胞體積顯著增大。其主要意義是為S期的DNA復(fù)制做好物質(zhì)和能量的準(zhǔn)備。在G1期晚期階段有一個(gè)特定時(shí)期，被稱為R點(diǎn)(Restriction point, 限制點(diǎn))，如果細(xì)胞能夠在內(nèi)外條件刺激下通過R點(diǎn)，則進(jìn)入S期。否則則被阻滯，進(jìn)入G0期（脫離細(xì)胞周期循環(huán)，直到條件合適重新進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)行分裂）。目前，關(guān)于G0期的檢查主要以Ki-67檢測為主，Ki-67在所有細(xì)胞周期中均表達(dá)。但當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入G0期等從而退出細(xì)胞周期時(shí)，Ki-67的表達(dá)水平則顯著降低。

在進(jìn)入S期后，細(xì)胞立刻開始合成DNA。此階段細(xì)胞主要負(fù)責(zé)合成DNA、組蛋白和DNA復(fù)制所需的絕大部分酶體。

復(fù)制完成后，細(xì)胞即進(jìn)入G2期。此時(shí)DNA已經(jīng)合成完畢。其他結(jié)構(gòu)物質(zhì)和相關(guān)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)也完成了進(jìn)入M期的準(zhǔn)備。和G1期類似，在G2晚期仍存在一個(gè)判斷是否進(jìn)入M期的檢控點(diǎn)。若無法通過則變?yōu)镚2期細(xì)胞，等待受到刺激后進(jìn)入周期完成細(xì)胞分裂。此階段主要的標(biāo)志物為pHH3和CCNA2。前者作為一種核心的組蛋白，其在Ser-10和Ser-28位點(diǎn)上的磷酸化轉(zhuǎn)變可以作為“驅(qū)動”染色質(zhì)凝聚的反式作用因子從而誘導(dǎo)G2期進(jìn)入M期。而CCNA2則結(jié)合CDK1(Cyclin dependent kinase,細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶)和CDK2產(chǎn)生CCNA2-CDK復(fù)合物，該復(fù)合物通過促進(jìn)S期中的DNA和中心體復(fù)制并在G2期推動有絲分裂來進(jìn)入M期。除了主要處于S期和G2期的CCNA以外，處于G1晚期的CCNE和處于G2和M期的CCNB1也分別作為細(xì)胞周期的標(biāo)志物被廣泛檢測。

M期為細(xì)胞分裂期，在此階段細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂（體細(xì)胞）和減數(shù)分裂（生殖細(xì)胞）。該階段細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生急速變化，但其呼吸作用降低，蛋白質(zhì)合成速度明顯下降，RNA等其他物質(zhì)合成幾乎停滯。在細(xì)胞完成分裂后，則立刻重新進(jìn)入G1期準(zhǔn)備下一次循環(huán)。

參考文獻(xiàn)：

[1]  Sun X et al. Chromosoma. 2018 Jun;127(2):175-186.

[2]  Hendzel MJ et al. Chromosoma 1997 Nov;106(6):348-60.

圖S1. 分離的人體脂肪細(xì)胞的純度和細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄譜的表達(dá)

圖S2. 不同患者群體之間的基因表達(dá)差異

為了驗(yàn)證該轉(zhuǎn)錄結(jié)果，作者對分離的成熟脂肪細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期蛋白染色，通過共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞周期蛋白在其活性狀態(tài)下定位于細(xì)胞核，于是，使用凝集素對脂肪細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)行共染色來進(jìn)一步確認(rèn)脂肪細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核定位（圖2a）。ICC(Immunocyto-chemistry，免疫細(xì)胞化學(xué))染色證實(shí)了轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)結(jié)果，顯示出一部分成熟脂肪細(xì)胞容易表達(dá)一般細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，如PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen，增殖細(xì)胞核抗原)和anillin(苯胺素)，以及Ki-67和CCND1，CCNE1（Cyclin E1，細(xì)胞周期蛋白E1）和CCNA2（Cyclin A2，細(xì)胞周期蛋白A2）的核表達(dá)（圖2a-c）。同時(shí)，作者對G2/M期標(biāo)志物pHH3(phosphohistone-H3，磷酸組蛋白H3)進(jìn)行染色，來檢測有絲分裂的脂肪細(xì)胞。結(jié)果顯示在成熟脂肪細(xì)胞中出現(xiàn)G2期相關(guān)的典型斑點(diǎn)狀，而無明亮的M期相關(guān)染色特征（圖2b,c）。同樣的，anillin（有絲分裂過程中能轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜）也未在脂肪細(xì)胞核外觀察到（圖2b,c）。此外，在整個(gè)研究過程中，通過DAPI染色沒有發(fā)現(xiàn)具有有絲分裂核或濃縮染色體的脂肪細(xì)胞。為了證實(shí)脂肪細(xì)胞分離過程中的膠原酶處理不會導(dǎo)致脂肪細(xì)胞再進(jìn)入細(xì)胞周期，作者對不同獨(dú)立個(gè)體的脂肪組織塊進(jìn)行IHC染色（補(bǔ)充表3）。IHC結(jié)果顯示所有檢測到的細(xì)胞周期標(biāo)志物均在脂肪組織塊內(nèi)的成熟脂肪細(xì)胞中表達(dá)（圖2d）。以及在任何脂肪細(xì)胞中均未觀察到表明有絲分裂的CCNB1的核表達(dá)。然而，在成熟脂肪細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中存在CCNB1，表明可能處于G2期（圖2d）。總之，這些數(shù)據(jù)表明顯示活躍細(xì)胞周期特征的成熟人類脂肪細(xì)胞不存在有絲分裂。

為了表征體內(nèi)脂肪細(xì)胞的細(xì)胞周期動力學(xué)，作者檢測了每個(gè)標(biāo)記物的脂肪細(xì)胞核陽性的百分比（圖2e）。定量分析顯示出個(gè)體和標(biāo)記物之間存在相當(dāng)大的異質(zhì)性：CCND1（啟動細(xì)胞周期進(jìn)入，并在整個(gè)細(xì)胞周期中維持表達(dá)）表達(dá)存在差異性（1-97％陽性細(xì)胞/個(gè)體；圖2b,e）；在G1/S期表達(dá)的CCNE1也廣泛表達(dá)（7-99%陽性細(xì)胞/個(gè)體；圖2b,e）。與預(yù)期結(jié)果相一致的是，G2期階段的兩個(gè)標(biāo)志物CCNA2和pHH3的表達(dá)水平較低（CCNA2，1-64%陽性細(xì)胞/個(gè)體；pHH3，0-49%陽性細(xì)胞/個(gè)體；圖2b,e)。這些結(jié)果證實(shí)了在活躍的細(xì)胞周期中，人成熟脂肪細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)譜具有相當(dāng)大的個(gè)體差異。

為了更好地了解個(gè)體間細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的變化，作者進(jìn)一步分析了受試者的臨床參數(shù)，包括肥胖測量值（BMI、體脂成分、脂肪質(zhì)量（kg）和腰圍）和循環(huán)血清成分，確定了肥胖和胰島素參數(shù)（C肽、血清胰島素水平和HOMA-IR）是與細(xì)胞周期標(biāo)志物相關(guān)的最重要的臨床因素（圖3a和圖S3a）（小編注：（C肽，C-Peptide，又稱連接肽，由胰島β細(xì)胞分泌，前體是胰島素原。胰島素原經(jīng)過剪切生成等分子量的胰島素和C肽，又因?yàn)镃肽半衰期長，因此可以通過檢測血液中C肽的水平來反應(yīng)胰島素的含量）。同樣的，CCND1和CCNA2的mRNA水平也與受試者C肽水平和BMI相關(guān)（圖S3b）。而在非糖尿病患者隊(duì)列中沒有發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞周期蛋白與長期血糖水平(HbA1c)或年齡之間的相關(guān)性（圖3a和圖S3a、圖S4）。

為了確定肥胖或高胰島素血癥是否推動脂肪細(xì)胞周期進(jìn)程，對CCNA2（CCNA2是S/G2期細(xì)胞的蛋白標(biāo)志物，可以鑒定已經(jīng)發(fā)展到靜止G0/G1期之后的細(xì)胞）和受試者臨床參數(shù)進(jìn)行了多元β回歸分析（圖S4）。結(jié)果顯示，當(dāng)調(diào)整參數(shù)時(shí)，肥胖測量值（以kg為單位的脂肪、體脂成分和BMI）可以對CCNA2的表達(dá)造成顯著差異（圖3b、c）。每增加一公斤脂肪量，CCNA2陽性的幾率增加4.9%（95%CI（confidenceinterval，置信區(qū)間；1.2%，8.8%）P=0.01；圖3d）。利用擬合的β回歸模型，將肥胖對細(xì)胞周期進(jìn)程的單獨(dú)影響進(jìn)行可視化分析，并將預(yù)測CCNA2陽性的脂肪細(xì)胞百分比含量作為脂肪量增加的函數(shù)（圖3d、e）。胰島素（C-肽）的調(diào)節(jié)作用顯示出較高水平；然而，較大的置信區(qū)間使得調(diào)節(jié)并不能引起顯著差異（圖3b）。定量PCR和測序結(jié)果表明，受試者高胰島素血癥與G2標(biāo)志物富集的轉(zhuǎn)錄譜相關(guān)（圖1d和圖S3）。

圖3. 脂肪細(xì)胞周期進(jìn)展與肥胖和高胰島素血癥有關(guān)

圖S3. 脂肪細(xì)胞周期再進(jìn)入標(biāo)志物與代謝參數(shù)相關(guān)

圖S4.統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞周期相關(guān)指標(biāo)與患者臨床參數(shù)的相關(guān)性

為了探究高胰島素血癥是否可以作為有絲分裂原并刺激脂肪細(xì)胞通過S期，作者使用基底細(xì)胞培養(yǎng)基(使用FBS，通常含有50pM胰島素)培養(yǎng)人類脂肪組織塊或剛分離的脂肪細(xì)胞，并加入或不加入外源性胰島素(100 nM)(圖4a)。為了追蹤DNA合成路線，將EdU(5-ethynyl-2′-deoxyuridine，5-乙炔基-2'-脫氧尿苷)和熒光染料添加到培養(yǎng)基中，并用共聚焦顯微鏡測量脂肪細(xì)胞核大小。培養(yǎng)4天后，完整脂肪細(xì)胞內(nèi)的EdU陽性脂肪細(xì)胞核清晰可見，表明成熟的人類脂肪細(xì)胞可以在體外合成DNA（圖4b），在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞也能夠合成DNA，而在添加100nM外源性胰島素組中，EdU陽性脂肪細(xì)胞的百分比和平均脂肪細(xì)胞核大小顯著增加（圖4c, d）。相比之下，使用活性炭處理過的FBS（CT-FBS；去除胰島素和生長因子）（小編注：有文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)過活性炭吸附的FBS常用于激素相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究，以提供無激素的細(xì)胞培養(yǎng)條件。

此外，在蛋白質(zhì)方面的研究表明，包括胰島素樣生長因子2（IGF-2）和IGF結(jié)合蛋白（IGFBP）-2和-6在內(nèi)的14種蛋白質(zhì)在這種FBS中減少。）培養(yǎng)導(dǎo)致DNA合成水平顯著降低（圖4e）。與預(yù)期一致，胰島素培養(yǎng)4天后，與EdU陰性脂肪細(xì)胞相比，EdU陽性脂肪細(xì)胞的細(xì)胞核更大，這表明脂肪細(xì)胞核大小的增加與DNA復(fù)制有關(guān)（圖4f）。接著，使用DNA染料進(jìn)行細(xì)胞核染色和流式細(xì)胞分析，結(jié)果顯示，胰島素培養(yǎng)4天的脂肪細(xì)胞亞群中的DNA含量增加了一倍，證實(shí)了EdU動力學(xué)，且說明細(xì)胞周期完全進(jìn)展到S期（圖4g和圖S5a）。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在許多核內(nèi)復(fù)制的細(xì)胞類型中，核的大小與細(xì)胞大小相關(guān)。雖然脂肪細(xì)胞肥大與肥胖相關(guān)，但目前對脂肪細(xì)胞核大小卻知之甚少。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)剛分離的非培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞的細(xì)胞大小隨BMI增加而增加，并表明細(xì)胞大小也與核大小相關(guān)（圖4h）。與細(xì)胞核大小的增加一致，與瘦個(gè)體相比，肥胖個(gè)體的細(xì)胞核DNA含量增加（圖S5b）。S/G2期標(biāo)志物CCNA2陽性的細(xì)胞核也明顯多于CCNA2陰性的細(xì)胞核（圖S5c）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明肥胖和高胰島素血癥是成人脂肪細(xì)胞和細(xì)胞核大小增加的驅(qū)動因素。體外胰島素治療可以促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，引起細(xì)胞核大小和DNA含量增加。

在體外實(shí)驗(yàn)中，作者測量了胰島素刺激后脂肪細(xì)胞中的EdU染色比例，并進(jìn)一步研究受試者代謝健康如何影響脂肪細(xì)胞通過S期的細(xì)胞周期進(jìn)程。從OB/NI和OB/HI個(gè)體以及未肥胖WOB（Without obesity）個(gè)體中分離的脂肪細(xì)胞樣品在含或不含基礎(chǔ)或外源胰島素的情況下培養(yǎng)4天，并檢測EdU陽性脂肪細(xì)胞的百分比含量。與先前研究一致，肥胖個(gè)體細(xì)胞周期標(biāo)志物表達(dá)增加（圖1d和3a-c），表明在基礎(chǔ)狀態(tài)下，個(gè)體肥胖程度（以kg為單位的脂肪量）與EdU陽性脂肪細(xì)胞的百分比呈正相關(guān)（圖S5d）。胰島素治療增加了所有個(gè)體的EdU染色水平（圖4c）；然而，在高胰島素血癥個(gè)體中，EdU染色水平的倍數(shù)變化減弱（圖S5e）。對胰島素的促有絲分裂反應(yīng)性降低可能反映了OB/HI個(gè)體中G2期停滯的脂肪細(xì)胞比例增加（圖1d和3a）或細(xì)胞對胰島素的反應(yīng)減弱。為了驗(yàn)證脂肪細(xì)胞對胰島素的反應(yīng)能力并非受肥胖或循環(huán)C肽水平的影響，作者使用100nM胰島素刺激剛分離的非培養(yǎng)脂肪細(xì)胞10分鐘，然后進(jìn)行WB，結(jié)果顯示所有脂肪細(xì)胞樣品中AKT-Ser473的磷酸化水平顯著升高（圖4i和圖S5f）。盡管在OB/HI個(gè)體中GLUT4表達(dá)的降低表現(xiàn)出胰島素抵抗，但AKT的激活與BMI、循環(huán)C肽水平或HOMA-IR無關(guān)，這證實(shí)了人脂肪細(xì)胞仍保留了對胰島素的應(yīng)答能力（圖4i）。

通過對三名肥胖個(gè)體的皮下脂肪細(xì)胞響應(yīng)胰島素水平（范圍：0.1-100nM）的深入分析表明，盡管高胰島素血癥患者的幾種胰島素反應(yīng)蛋白的表達(dá)較低，但其相對磷酸化反應(yīng)相對一致（圖4J和圖S5g）。這些結(jié)果表明，CCND1位于促有絲分裂胰島素信號通路的下游，其表達(dá)模式與胰島素反應(yīng)相反，且在高胰島素血癥個(gè)體中可以檢測到更高水平的CCND1。

熱圖結(jié)果顯示：其中基因表達(dá)發(fā)生顯著變化的共有1416個(gè)基因，在WT和ACTN3 KO小鼠中，地塞米松注射3小時(shí)的轉(zhuǎn)錄變化影響最為顯著(圖3A)?；鹕綀D分別顯示了地塞米松處理(圖3B)后的差異表達(dá)基因和ACTN3 WT和KO(圖3C)影響的差異表達(dá)基因變化。進(jìn)一步通過相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然在地塞米松處理后3小時(shí)和24小時(shí)后，WT和ACTN3 KO小鼠對地塞米松處理具有類似變化(圖3D)，但是通過Pearson相關(guān)系數(shù)對ACTN3的基因型和地塞米松影響的交互作用分析顯示，ACTN3 KO小鼠對地塞米松的反應(yīng)存在特異性的差異表達(dá)基因，其中包括了5個(gè)特別的基因[Tmem100(q=0.00623)、Cbx8(q=0.049)、Mras(q=0.049)、2310022B05Rik(q=0.0550)、和Mstn(q=0.1238)]，且這些基因與肌肉生長與消耗或免疫表型相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。

進(jìn)一步的基因富集分析顯示了ACTN3基因型對地塞米松的總體反應(yīng)(圖3F)，結(jié)果表明：地塞米松產(chǎn)生的效應(yīng)與“細(xì)胞外滲的調(diào)節(jié)”、“單核細(xì)胞趨化的調(diào)節(jié)”和“細(xì)胞防御反應(yīng)”等免疫反應(yīng)相關(guān)與相關(guān)，而ACTN3基因型效應(yīng)則與“肌肉適應(yīng)”和“肌肉萎縮”相關(guān)。進(jìn)一步分析顯示， ACTN3基因型對地塞米松的反應(yīng)也存在不同發(fā)育時(shí)間性的差異，這種差異主要體現(xiàn)在淋巴細(xì)胞遷移和腎上腺素受體信號上。WT和ACTN3 KO的“淋巴細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)”的對比圖(圖3G)表明在沒有ACTN3的情況下，骨骼肌對地塞米松的免疫抑制反應(yīng)減弱?？傊?strong>上述結(jié)果進(jìn)一步證明了ACTN3 KO可以緩解肌肉中地塞米松誘導(dǎo)的肌肉萎縮反應(yīng)。 

與肥胖、細(xì)胞大?。▓D4h）和CCND1、CCNA2、pHH3（圖3a,b）的正相關(guān)相反的是，增殖標(biāo)志物Ki-67和PCNA（Ki-67或PCNA的表達(dá)降低是細(xì)胞周期結(jié)束的標(biāo)志）的表達(dá)隨著肥胖的增加而降低(圖5a)。隨著高胰島素血癥水平的下降其表達(dá)也相應(yīng)降低（圖S6a）。此外，來自O(shè)B/HI個(gè)體的脂肪細(xì)胞具有G2期標(biāo)志物（圖1d和3a)，表明它們可能在G2期中被阻滯并結(jié)束細(xì)胞周期。如上所述，來自高胰島素血癥個(gè)體的脂肪細(xì)胞也表達(dá)高水平的CCND1（圖3a和4j）。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這些標(biāo)志物除了具有啟動細(xì)胞周期中的作用之外，還發(fā)揮多種非經(jīng)典作用。為了探究脂肪細(xì)胞表現(xiàn)出高水平的CCND1，低表達(dá)水平的Ki-67和PCNA的原因，作者利用轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)對所有CCND1相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的富集途徑進(jìn)行分析，結(jié)果表明在其相關(guān)的信號通路中，細(xì)胞衰老是最重要的通路，其次是與細(xì)胞周期進(jìn)程和DNA損傷反應(yīng)相關(guān)的通路（圖S6b）。此外，脂肪細(xì)胞CCND1表達(dá)與幾種衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)有關(guān)（圖5b）。總之，這些數(shù)據(jù)表明，衰老的脂肪細(xì)胞高表達(dá)CCND1，并且衰老的脂肪細(xì)胞在高胰島素血癥肥胖個(gè)體中不斷積累。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，小鼠脂肪組織和人前體脂肪細(xì)胞存在細(xì)胞衰老的現(xiàn)象，但在人成熟脂肪細(xì)胞中沒有描述。作者通過對剛分離的脂肪細(xì)胞進(jìn)行SABG(β-半乳糖苷酶活性染色)，證實(shí)了人成熟脂肪細(xì)胞能夠發(fā)生細(xì)胞衰老。WOB個(gè)體和OB/NI個(gè)體的脂肪細(xì)胞中SABG染色非常弱甚至無法被檢測到，但高胰島素血癥的受試者中SABG染色效果明顯（圖5c）。對單個(gè)脂肪細(xì)胞進(jìn)行SABG染色呈現(xiàn)核周染色模式，與組織切片中β-半乳糖苷酶蛋白的IHC染色結(jié)果相同（圖5d和圖S6c）。對SABG陽性脂肪細(xì)胞百分比含量定量分析發(fā)現(xiàn)，與OB/NI和WOB個(gè)體相比，OB/HI受試者中衰老脂肪細(xì)胞的百分比含量顯著增加（圖5e和圖S6d）。對OB/NI和OB/HI個(gè)體的BMI數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)驅(qū)動脂肪細(xì)胞衰老的主要原因并不是肥胖，而是高胰島素血癥（圖S6e，S7）。為了進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)論，作者進(jìn)行了多重零膨脹β回歸分析。該模型預(yù)估有68%的個(gè)體對脂肪細(xì)胞衰老敏感，并證實(shí)胰島素血癥是唯一顯著影響易感受試者衰老脂肪細(xì)胞比例的因素（圖5f)。對于易感受試者，每增加1nM的C肽，SABG陽性細(xì)胞的幾率便會增加6.9%，表明高胰島素血癥的強(qiáng)烈作用（圖S6f）。重要的是，年齡和性別的調(diào)整效應(yīng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且未發(fā)現(xiàn)SABG染色結(jié)果與人年齡之間存在相關(guān)性（圖2，圖5f，g和圖S6g）。

接下來，作者檢測了衰老細(xì)胞的其他標(biāo)志物。結(jié)果顯示，HMGB1(Highmobility group B1,高遷移率族蛋白B1，一種成熟的衰老標(biāo)志物）的缺失與SABG陽性細(xì)胞的百分比相關(guān)（圖5b），證實(shí)了SABG的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖S6h和S7）。與衰老導(dǎo)致細(xì)胞大小增加說法一致的是，同一個(gè)體的SABG陽性脂肪細(xì)胞也明顯大于SABG陰性細(xì)胞（圖5h）。不僅如此，在脂肪細(xì)胞中典型的衰老標(biāo)志p16蛋白表達(dá)水平顯著升高（圖5i），p16陽性的脂肪細(xì)胞百分比含量與受試者C肽水平相關(guān)（圖5j）并顯示出隨BMI增加的趨勢（圖5k）。p16(CDKN2A)在測序數(shù)據(jù)中的mRNA表達(dá)水平非常低，說明其僅受到較弱的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（圖5b和6e）。相反，在高胰島素血癥的肥胖個(gè)體中p21(CDKN1A)的轉(zhuǎn)錄水平大幅上調(diào)（圖5b），這進(jìn)一步證實(shí)了慢性高胰島素血癥可以導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞衰老。由于DNA損傷已被證明可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，作者便通過持續(xù)的、易擴(kuò)散的γ-H2AΧ染色檢測脂肪細(xì)胞的細(xì)胞核，來研究穩(wěn)定且未被修復(fù)（non-resolved）的DNA損傷反應(yīng)的表達(dá)（圖5I）（小編注：細(xì)胞在發(fā)生DNA雙鏈斷裂后，隨即產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)，許多翻譯后修飾作為損傷應(yīng)答的分子開關(guān)。H2AX是組蛋白H2A家族成員之一，在細(xì)胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂后被ATM，ATR和PRKDC磷酸化，形成γH2AX，進(jìn)而迅速招募DNA修復(fù)蛋白和凋亡蛋白到損傷部位。由于γH2AX的出現(xiàn)與DNA雙鏈斷裂緊密關(guān)聯(lián)，可以作為DNA雙鏈斷裂的標(biāo)志物。）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)γ-H2AΧ染色程度隨受試者BMI增加而增加，但不隨C肽的變化而變化（圖5l-m）。這一結(jié)果與先前的研究一致，表明了在肥胖人群中存在活躍的DNA損傷反應(yīng)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明人類脂肪組織中的成熟脂肪細(xì)胞可以激活細(xì)胞周期程序和與高胰島素血癥有關(guān)的細(xì)胞衰老，并表達(dá)大多數(shù)典型的衰老標(biāo)志物（圖S7和補(bǔ)充表9）。

衰老被認(rèn)為是持續(xù)的有絲分裂刺激和內(nèi)源性CDK抑制劑（如p16和p21）表達(dá)之間的內(nèi)在沖突引起的。為了研究高胰島素血癥誘導(dǎo)的細(xì)胞周期重入進(jìn)程是否可以調(diào)節(jié)人脂肪細(xì)胞的衰老，作者使用了目前市場上用于其他方面治療的兩種藥物：用于治療乳腺癌的帕博西尼(Palbociclib，0.5uM），類似于p16和p21，其通過抑制CDK4/CDK6阻斷細(xì)胞周期；二甲雙胍(metformin，5mM)，常用于治療2型糖尿病，其能夠阻斷mTOR介導(dǎo)的CCND1上游的促有絲分裂信號。EdU染色水平下降表明這兩種藥物均可有效抑制人脂肪細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程（圖6g-j）。帕博西尼對CCND1水平的影響較小，因?yàn)樗柚沽思?xì)胞周期的進(jìn)程而非細(xì)胞周期的啟動（圖6h）。作者通過帕博西尼與促有絲分裂刺激（胰島素）的聯(lián)合處理，以增強(qiáng)內(nèi)部細(xì)胞周期和細(xì)胞阻滯的沖突比率，來模擬內(nèi)源性p16/p21活性， SABG染色結(jié)果顯示脂肪細(xì)胞衰老程度增加（圖6i）。SABG對帕博西尼治療的反應(yīng)高度依賴于個(gè)體的血清胰島素水平，其中高胰島素血癥個(gè)體的脂肪細(xì)胞樣本的SABG染色效果最強(qiáng)（圖S8c）。在胰島素存在下，帕博西尼也增加了除p21和p16以外的幾個(gè)衰老相關(guān)基因（圖6e）。然而，在培養(yǎng)7天后，帕博西尼并未顯著增加SASP的分泌，這表明盡管帕博西尼阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程可以誘導(dǎo)SABG，但此時(shí)并不足以誘導(dǎo)SASP（圖S8d)。先前的文獻(xiàn)研究表明，單獨(dú)使用帕博西尼無法誘導(dǎo)SASP，還需要使用MEK抑制劑聯(lián)合處理。

與帕博西尼相比，二甲雙胍不僅降低了細(xì)胞周期進(jìn)程，而且還有效地減少了mTOR信號，如mTOR下游靶標(biāo)p70S6K的磷酸化水平（圖6j，S8e，S8f）和CCND1蛋白的表達(dá)水平（圖6k）均大幅下降。此外，與單獨(dú)使用胰島素或胰島素與帕博西尼聯(lián)合處理相比，二甲雙胍顯著降低了所有樣本中衰老SABG陽性細(xì)胞的百分比，且與活檢供體的代謝狀態(tài)無關(guān)（圖6l和圖S8g）。不僅如此，二甲雙胍還阻斷了衰老轉(zhuǎn)錄程序的表達(dá)，而不是誘導(dǎo)與靜止相關(guān)的基因的表達(dá)（圖6e）。這與LY294002（圖6b-d）處理結(jié)果一致，均抑制了AKT-mTOR通路上游的促有絲分裂胰島素信號并顯著降低了脂肪細(xì)胞的衰老（圖6d）。二甲雙胍治療7天顯著降低了大多數(shù)SASP的分泌（圖6f）。這種降低不是由于蛋白質(zhì)分泌的普遍下調(diào)，因?yàn)樵诙纂p胍處理后培養(yǎng)基中沒有檢測到脂聯(lián)素（或選擇性的SASP蛋白）分泌水平的差異，也沒有檢測到任何細(xì)胞毒性或細(xì)胞破裂（圖S8h,i）。這些數(shù)據(jù)表明，抑制細(xì)胞周期進(jìn)入上游的脂肪細(xì)胞衰老可能引起脂肪組織功能的抗炎作用（圖S9a）。

綜上所述，本研究證實(shí)了在促有絲分裂信號增加的情況下，如慢性高胰島素血癥或體外長期胰島素刺激，可以通過引起細(xì)胞周期進(jìn)展使皮下脂肪細(xì)胞數(shù)目增加，細(xì)胞周期阻滯劑p16和p21的轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加和衰老脂肪細(xì)胞的數(shù)量增加。通過使用帕博西尼培養(yǎng)脂肪細(xì)胞能夠增強(qiáng)細(xì)胞周期阻滯從而增加衰老脂肪細(xì)胞數(shù)量，而使用二甲雙胍或LY294002抑制上游有絲分裂信號傳導(dǎo)能夠完全抑制皮下脂肪組織中衰老的誘導(dǎo)（圖S9a）。

 總結(jié)

 

細(xì)胞

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