吉林省梨樹縣第一高級(jí)中學(xué) 姜萬(wàn)錄
高考要求
實(shí) 驗(yàn)
要 求
（1）微生物的分離和培養(yǎng)
（2）某種微生物數(shù)量的測(cè)定
（3）培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用 （4)利用微生物發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)特定的產(chǎn)物以及微生物在其他方面的應(yīng)用
掌握程度參考本考試大綱中的：
一、考核目標(biāo)與要求
2．實(shí)驗(yàn)與探究能力
知識(shí)整合
一、培養(yǎng)基
1.定義：人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)――培養(yǎng)基。
2. 培養(yǎng)基的類型及其應(yīng)用：
標(biāo)準(zhǔn)
培養(yǎng)基類型
配制特點(diǎn)
主要應(yīng)用
物理性質(zhì)
固體培養(yǎng)基
加入瓊脂較多
菌種分離,鑒定,計(jì)數(shù)
半固體培養(yǎng)基
加入瓊脂較少
菌種保存
液體培養(yǎng)基
不加入瓊脂
工業(yè)生產(chǎn)，連續(xù)培養(yǎng)
化學(xué)組成
合成培養(yǎng)基
由已知成分配制而成，培養(yǎng)基成分明確
菌種分類、鑒定
天然培養(yǎng)基
由天然成分配制而成，培養(yǎng)基成分不明確
工業(yè)生，產(chǎn)降低成本
目的用途
鑒別培養(yǎng)基
添加某種指示劑或化學(xué)藥劑
菌種的鑒別
選擇培養(yǎng)基
添加（或缺少）某種化學(xué)成分
菌種的分離
3.微生物培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)
水
無(wú)機(jī)鹽
碳源
氮源
生長(zhǎng)因子
概
念
供給微生物碳素營(yíng)養(yǎng)的物質(zhì)
能被微生物吸收利用的含氮物質(zhì)
某些微生物生長(zhǎng)所必需的少量物質(zhì)
來(lái)
源
磷酸鹽、硫酸鹽、鉀、鈉、鈣、鎂、鐵等鹽類
無(wú)機(jī)碳:CO2、NaHCO3等
有機(jī)碳源：糖類（最常）、脂肪酸、花生粉餅、石油等
無(wú)機(jī)氮源：N2、氨、銨鹽、硝酸鹽等
有機(jī)氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉等
維生素、氨基酸、堿基、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、動(dòng)植物組織提取液（肝臟浸出液、麥芽汁）
作
用
微生物細(xì)胞的組成成分，溶解物質(zhì)，生物化學(xué)反應(yīng)的介質(zhì)
為微生物生長(zhǎng)繁殖及其一系列生命活動(dòng)提供不可缺少的礦質(zhì)元素
要用于合成微生物的細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物;異養(yǎng)微生物的主要能源物質(zhì).
主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氮的代謝產(chǎn)物。
一般是酶和核酸的組成成分。
說(shuō)
明
不同種類的微生物，對(duì)碳源的需要差別較大，而且微生物對(duì)碳源的需求量最大。
異養(yǎng)微生物：含C、H、O、N的化合物既是碳源又是氮源
微生物之所以要補(bǔ)充生長(zhǎng)因子，往往是由于缺乏合成這些物質(zhì)所需要的酶或合成能力有限
4.微生物和動(dòng)物、植物營(yíng)養(yǎng)要素的比較
生物類型
營(yíng)養(yǎng)要素
動(dòng)物
（異養(yǎng)）
微生物
綠色植物
異養(yǎng)
自養(yǎng)
碳源
糖類脂肪
糖、醇、有機(jī)酸等
二氧化碳、碳酸鹽等
二氧化碳、碳酸鹽
氮源
蛋白質(zhì)或其降解物
蛋白質(zhì)或其降解物、有機(jī)氮化物、無(wú)機(jī)氮化物、氮
無(wú)機(jī)氮化物、氮
無(wú)機(jī)氮化物
能源
與碳源相同
與碳源相同
氧化有機(jī)物或利用光能
利用光能
生長(zhǎng)因子
維生素
一部分需要生長(zhǎng)因子
不需要
不需要
無(wú)機(jī)元素
無(wú)機(jī)鹽
無(wú)機(jī)鹽
無(wú)機(jī)鹽
無(wú)機(jī)鹽
水分
水
水
水
水
5.微生物營(yíng)養(yǎng)類型
營(yíng)養(yǎng)類型
主要或唯一碳源
能源
代表菌
光能自養(yǎng)型
CO2
光能
藍(lán)細(xì)菌
光能異養(yǎng)型
有機(jī)物
光能
紅螺菌
化能自養(yǎng)型
CO2
無(wú)機(jī)物
硝化細(xì)菌
化能異養(yǎng)型
有機(jī)物
有機(jī)物
大腸桿菌
6.培養(yǎng)基的配制原則：
①目的要明確：根據(jù)培養(yǎng)的微生物種類、培養(yǎng)的目的等確定培養(yǎng)基的類型和配制量。
②營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)：培養(yǎng)基中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例要適宜。例如：碳氮比4∶1時(shí)，谷氨酸棒狀桿菌大量繁殖而產(chǎn)生谷氨酸少；碳氮比為3∶1時(shí)，菌體繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。
③pH要適宜：細(xì)菌培養(yǎng)基pH中性或偏堿性，霉菌培養(yǎng)基呈酸性。
二、無(wú)菌技術(shù)
1.無(wú)菌技術(shù)的內(nèi)容
(1)對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。
(2)將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。
(3)為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。
(4)實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸
2.消毒和滅菌的區(qū)別
條 件
結(jié) 果
能否消滅芽孢和孢子
常用方法
消毒
較為溫和的物理或化學(xué)方法
殺死物體表面或內(nèi)部的部分對(duì)人體有害的微生物
不能
煮沸消毒法
巴氏消毒法
化學(xué)藥劑消毒法等
滅菌
強(qiáng)烈的理化因素
殺死物體內(nèi)外所有微生物
能
高壓蒸汽滅菌法
干熱滅菌法
灼燒滅菌法
3.常見消毒滅菌方法比較
方 法
操作過程
應(yīng)用范圍
消
毒
煮沸消毒法
100℃煮沸5～6min
日常生活中廣泛使用
巴氏消毒法
60～80℃下處理15～30min
牛奶、啤酒、果酒和果醬等不宜進(jìn)行高溫消毒的液體
化學(xué)藥物消毒法
用體積分?jǐn)?shù)為70～75%的乙醇、碘酒涂抹，來(lái)速水噴灑等
用于皮膚、傷口、動(dòng)植物組織表面消毒，空氣、手術(shù)器械、塑料或玻璃器皿等
紫外線消毒法
30W紫外燈照射30min
接種室空氣
滅
菌
灼燒滅菌法
酒精燈火焰灼燒
微生物接種工具如接種環(huán)、接種針或其它金屬用具等，接種過程中試管口活錐形瓶瓶口等
干熱滅菌法
電熱鼓風(fēng)干燥箱160～170℃加熱1～2h
玻璃器皿（如吸管、培養(yǎng)皿等）、金屬用具等凡是不適宜用其他方法滅菌而又能耐高溫的物品。
高壓蒸汽滅菌法
100kPa、121℃維持15～30min
培養(yǎng)基及多種器材、物品
4. 原理：在高溫高壓、化學(xué)藥劑、強(qiáng)酸強(qiáng)堿作用下，使微生物蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到殺菌的目的。
三、實(shí)驗(yàn)操作
1.微生物培養(yǎng)、分離、計(jì)數(shù)和鑒定比較
大腸桿菌純化培養(yǎng)
土樣中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)
分解纖維素微生物的分離
實(shí)
驗(yàn)
原
理
1.培養(yǎng)基配制原理：微生物生長(zhǎng)繁殖時(shí)需要各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，一般包括水、無(wú)機(jī)鹽、碳源和氮源，有的還需要少量特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（生長(zhǎng)因子）。根據(jù)微生物的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，選擇不同的原料配制不同培養(yǎng)基，配后要及時(shí)滅菌。本課題使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，它是一種應(yīng)用最廣泛和最普遍的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，也稱普通培養(yǎng)基。它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl，其中牛肉膏為細(xì)菌提供碳源和能源，磷酸鹽；蛋白胨主要提供氮源；而NaCl提供無(wú)機(jī)鹽。在配制固體培養(yǎng)基時(shí)還要加入瓊脂作凝固劑。在培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)要用稀酸或稀堿將pH調(diào)至中性或微堿性，以利于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方見人教版選修1教材P.15。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需要的最基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以可供細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖之用。
2. 無(wú)菌操作原理：針對(duì)不同對(duì)象采用不同的消毒和滅菌的方法，在高溫、高壓、化學(xué)藥劑、強(qiáng)酸和強(qiáng)堿作用下，使微生物蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到殺菌的目的。本實(shí)驗(yàn)采用酒精對(duì)實(shí)驗(yàn)者雙手消毒，紫外線對(duì)操作環(huán)境照射消毒，對(duì)培養(yǎng)基采用高壓蒸汽滅菌，對(duì)玻璃器皿進(jìn)行干熱滅菌和接種環(huán)灼燒滅菌等。
3. 純化大腸桿菌的原理：為了獲得大腸桿菌的純培養(yǎng)，選用平板劃線法或稀釋涂布平板法，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上操作，在培養(yǎng)基上將大腸桿菌稀釋或分散成單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后可分離得到由單個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的子細(xì)胞群，即菌落。這個(gè)菌落就是一個(gè)純化的細(xì)菌菌落，這樣就達(dá)到分離純化的目的。
1.分解尿素細(xì)菌的篩選原理：能合成脲酶的細(xì)菌才能分解尿素。配制以尿素為惟一氮源的培養(yǎng)基，能夠生長(zhǎng)的細(xì)菌就是能分解尿素的細(xì)菌。
2.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目原理：
（1）直接計(jì)數(shù)法：這種方法是指利用特定的細(xì)菌計(jì)數(shù)板或者血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積樣品中微生物的數(shù)量。計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，上面有一個(gè)面積為1 mm2和高0.1 mm的計(jì)數(shù)室，該計(jì)數(shù)室又均分成400個(gè)小格。測(cè)量時(shí)將稀釋的樣品滴加在計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，然后在顯微鏡下數(shù)出每個(gè)小格所含的細(xì)菌的平均數(shù)，再按下面的公式求出每毫升樣品所含的細(xì)菌數(shù)。
每毫升原液所含的細(xì)菌數(shù)＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×1 000×稀釋倍數(shù)（此方法的缺點(diǎn)是分不清活菌和死菌。）
2.間接計(jì)數(shù)法
稀釋涂布平板法，常用來(lái)統(tǒng)計(jì)樣品中的活菌數(shù)，當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活細(xì)菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般設(shè)置3～5個(gè)平板，選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并取平均值。計(jì)算公式：每克樣品中的菌落數(shù)=（某稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)c÷涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積v）×稀釋倍數(shù)M.。統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低，原因是如果稀釋的倍數(shù)不夠大，很可能出現(xiàn)兩個(gè)或者更多的細(xì)菌在一起共同形成一個(gè)菌落的情況，在最后計(jì)算時(shí)，我們卻是按照一個(gè)細(xì)菌來(lái)計(jì)算的。因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來(lái)表示。
剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理:剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。當(dāng)我們?cè)诤欣w維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時(shí)，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅－纖維素的復(fù)合物就無(wú)法形成，培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣，我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來(lái)篩選纖維素分解菌。
實(shí)
驗(yàn)
流
程
1. 制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基
計(jì)算→稱量→溶化→滅菌→倒平板
2.純化大腸桿菌
平板劃線操作和稀釋涂布平板操作→培養(yǎng)
土壤取樣→配制土壤溶液和制備培養(yǎng)基→系列稀釋→涂布平板與培養(yǎng)→菌落計(jì)數(shù)
土壤取樣→選擇培養(yǎng)（此步是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來(lái)確定）→梯度稀釋→將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上→挑選產(chǎn)生透明圈的菌落
注
意
事
項(xiàng)
配制微生物培養(yǎng)基時(shí)注意事項(xiàng)：（1）溶化瓊脂時(shí)要控制火力的大小并不斷攪拌，以免培養(yǎng)基溢出或燒焦；（2）加熱過程中部分水分蒸發(fā)，待瓊脂完全溶化后應(yīng)補(bǔ)加蒸餾水，以保持溶液的濃度；（3）分裝至試管時(shí)培養(yǎng)基的高度不要超過試管高度的1/5；（4）一般是培養(yǎng)基先滅菌再倒平板，也可先倒平板,課間再滅菌；（5）冷卻后的平板要倒置，以確保拿放方便，同時(shí)避免水分蒸發(fā)，以利微生物生長(zhǎng)。
劃線操作時(shí)注意：（1）用接種環(huán)取菌種之前、每次劃線之前和劃線結(jié)束都要進(jìn)行灼燒滅菌，灼燒后要在酒精燈附近冷卻后再操作；（2）劃線時(shí)不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基，如果采用分段劃線法操作從第二次操作應(yīng)總在上一次劃線末端開始，首尾區(qū)不能相連；（3）操作必須始終在酒精燈火焰旁進(jìn)行。
涂布操作時(shí)注意：（1）配制系列梯度稀釋液時(shí)，所用的試管和移液管均需滅菌，必須用無(wú)菌水配制；（2）涂布器用70%的酒精消毒，多余酒精在燒杯中滴盡，沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰引燃。不要將過熱的涂布器放入盛有酒精的燒杯中，一面引燃其中的酒精；（3）配制系列梯度稀釋液和轉(zhuǎn)移菌液以及涂布過程等必須都在酒精燈火焰旁進(jìn)行，移液管頭不能接觸任何物體。
不同的微生物培養(yǎng)時(shí)所需的溫度和培養(yǎng)時(shí)間都不同，不能一概而論。例如細(xì)菌一般需要在30～37 ℃培養(yǎng)1～2天；放線菌一般在25～28 ℃培養(yǎng)5～7天；霉菌一般在25～28 ℃培養(yǎng)3～4天。
（1）整個(gè)過程中要注意無(wú)菌操作，一定要建立“有菌觀念”，知道雜菌無(wú)處不在。對(duì)不同的器具要選擇不同的滅菌方法。
（2）做好標(biāo)記：整個(gè)操作中所用的培養(yǎng)皿、試管、吸管等都很多，因此要事先做好標(biāo)記，避免混淆。
（3）規(guī)劃時(shí)間：微生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)都是耗時(shí)很長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)，因此要事先規(guī)劃好時(shí)間，以便提高工作效率。
（4）實(shí)驗(yàn)完成后，不同的實(shí)驗(yàn)小組要對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較，如果結(jié)果相差很大，一定要分析其原因。
培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落：對(duì)照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長(zhǎng)則說(shuō)明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說(shuō)明可能獲得了分解纖維素的微生物。
分離的結(jié)果是否一致：由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，學(xué)生也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。
2.劃線接種的基本步驟和說(shuō)明
序列
操作步驟
分析說(shuō)明
1
將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅
將接種環(huán)滅菌，避免污染菌種
2
在火焰旁冷卻接種環(huán)，拔除盛有菌液的試管棉塞
避免雜菌污染菌種
3
將試管口通過火焰
灼燒滅菌，防止試管口菌體污染培養(yǎng)基
4
將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中，沾取菌液
冷卻接種環(huán)可避免殺死菌種
5
將試管口通過火焰，并塞上棉塞
避免試管口雜菌污染菌種
6
左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基
初步接種。劃破培養(yǎng)基不利于后續(xù)的繼續(xù)劃線，長(zhǎng)出的菌落不標(biāo)準(zhǔn)
7
灼燒接種環(huán)，冷卻后從第一區(qū)劃線的末端向第二區(qū)劃線。重復(fù)以上操作，在第三、四、五區(qū)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連
從上個(gè)區(qū)域的末端向下個(gè)區(qū)域劃線,可逐步分離出單個(gè)菌體，從而實(shí)現(xiàn)微生物的純化
8
將平板倒置，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
倒置平板防止水分蒸發(fā)，也方便拿放
3.兩種“剛果紅染色法”比較
染色法
優(yōu)點(diǎn)
缺點(diǎn)
方法一
顏色反應(yīng)基本上是
纖維素分解菌的作用
操作繁瑣
剛果紅會(huì)使菌落之間發(fā)生混雜
方法二
操作簡(jiǎn)便
不存在菌落混雜問題
產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈，
有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。
