| 魚類抗病毒非特異性免疫機(jī)制研究進(jìn)展 |
| 山東省水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中心 2009年1月5日 |
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王亞楠1，2，孔曉瑜1，史成銀2 (1．中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003； 2．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071) 摘要：魚類抗病毒非特異性免疫系統(tǒng)主要包括自然殺傷細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)及干擾素，蛋白因子白介素、趨化因子、腫瘤壞死因子及干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白激酶PKR、Mx蛋白、主要組織相容性蛋白、一氧化氮合成酶在魚類抗病毒免疫中發(fā)揮重要的作用。了解病毒與魚體之間的相互作用機(jī)理，為魚類病毒性疾病防控奠定基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：魚類；抗病毒；非特異性免疫 魚類病毒病是嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的世界性難題。經(jīng)典的免疫學(xué)理論將機(jī)體的抗病毒免疫分為兩部分，即特異性免疫及非特異性免疫。在進(jìn)化過程中，魚類處于連接高等脊椎動(dòng)物和低等無脊椎動(dòng)物的特殊地位。其特異性免疫機(jī)制不完善，非特異性免疫占重要地位，免疫易受水溫的影響。 遇到病原后，首先并迅速起防衛(wèi)作用的是非特異性免疫應(yīng)答。在魚類體內(nèi)執(zhí)行非特異性免疫應(yīng)答的有吞噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及血液和體液中存在的抗菌分子，它們?cè)隰~類防止感染中扮演重要角色。對(duì)于病毒而言，具有重要意義的非特異性免疫細(xì)胞有兩類，一類是自然殺傷細(xì)胞(NK)，另一類是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)。與此同時(shí)，某些非特異性的體液因子也發(fā)揮了重要作用，其中最具代表意義的是干擾素(IFN)。 1 自然殺傷細(xì)胞 自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)是一類由骨髓干細(xì)胞分化而來的非特異殺傷細(xì)胞。表型特點(diǎn)是表達(dá)其表面特有的抗原標(biāo)記CD56和CD16。從細(xì)胞特性來說，NK細(xì)胞既參與非特異性免疫應(yīng)答，也通過與特異性T淋巴細(xì)胞在殺傷功能上的互補(bǔ)作用參與特異性免疫應(yīng)答。在病毒感染中，NK 細(xì)胞通過多糖及脂多糖分子直接殺傷被病毒感染的組織細(xì)胞；同時(shí)，還能夠以另一種與其他受體交聯(lián)識(shí)別的方式殺傷病毒感染的細(xì)胞。大多數(shù)病毒感染細(xì)胞后主動(dòng)下調(diào)宿主細(xì)胞表面MHCⅠ類分子的表達(dá)，從而避開MHCⅠ類分子限制的細(xì)胞毒性殺傷作用(CTL)對(duì)感染細(xì)胞的殺傷，而NK細(xì)胞所表達(dá)的殺傷抑制受體(killer inhibitory receptor，KIR)與CD16及多糖蛋白受體的交聯(lián)，可識(shí)別那些由于病毒感染而下調(diào)了MHCⅠ類分子表達(dá)的細(xì)胞。另外，NK細(xì)胞表面具有白介素2(IL-2)和白介素12(IL-12)受體，在病毒侵入機(jī)體形成最初炎癥時(shí)，可以被炎性因子及趨化因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-2直接激活而成為抗病毒感染的前鋒。同時(shí)，NK 細(xì)胞在激活后還可分泌γ干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)。 1．1 白介素 白介素(Interleukin，IL)是與魚類致炎作用以及調(diào)理功能密切相關(guān)的一個(gè)功能性蛋白家族。白介素家族的典型成員包括了IL-1，IL-2，IL-6等，其中IL-1包括IL-1α，IL-1β1和IL-1β2都屬于三葉草型細(xì)胞因子家族的成員。在魚的體內(nèi)，白介素樣分子參與并且在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。已經(jīng)報(bào)道在鯉魚(Cyprinus carpio)、斑點(diǎn)叉尾鲴(Ictalurus punctatus)和大西洋鮭(Salmo salar)體內(nèi)存在IL-1樣分子。Pelegry P等用RT-PCR方法分離克隆了烏頰海鯛(Aparus macrocephalus)的IL-1β基因。Engelsma M Y等檢測(cè)了鯉魚腦、垂體、頭腎、脾臟中的IL-1βmRNA 的表達(dá)。Kono T等用DNA注射方法研究鯉魚對(duì)于IL-1β的免疫反應(yīng)。Bird S 等用RT-PCR 方法在小點(diǎn)貓鯊(Scyliorhinus canicula)的脾臟和睪丸中發(fā)現(xiàn)有IL-1β基因的表達(dá)，并且證明其和虹鱒IL-1β有31.7%的相同氨基酸組成。董偉仁等利用比較基因組學(xué)方法，在河豚(Fugu rubripes)基因組中鑒定了IL-2基因。邱麗華等采用同源克隆和末端快速擴(kuò)增(RACE)的方法，從經(jīng)LPS刺激的花鱸(Lateolabrax japonicus)總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中獲得了803 bp的IL-8 cDNA序列。 1．2 趨化因子 趨化因子包括了約4O種小分子分泌型細(xì)胞因子，根據(jù)氨基酸序列中頭兩個(gè)半胱氨酸殘基的總數(shù)目進(jìn)行分類，可分為CXC、CC、C和CX3C等幾種。在魚類中，已見報(bào)道的有CXC和CC家族的成員，趨化因子受體基因也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)。首先報(bào)道的魚類趨化因子屬于CXC型，它是由一種元頜魚七鰓鰻(Lam petra fluviatilis)編碼的類L8多肽，Liu L等克隆了虹鱒(Oncorhynchus mykiss)體內(nèi)的趨化因子家族的CC基因。Kuroda N等鑒定了硬骨魚類趨化因子家族的7個(gè)新成員。與在哺乳動(dòng)物體內(nèi)一樣，魚類體內(nèi)的趨化因子在中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移過程中可以作為潛在化學(xué)引誘物存在。其激活一般要和有7個(gè)跨膜區(qū)域的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合共調(diào)節(jié)。 1．3 腫瘤壞死因子-α 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是魚類體內(nèi)存在的腫瘤壞死因子的主要成員。TNF-α是β-Jellyroll家族的成員，在細(xì)胞膜內(nèi)以Ⅱ型跨膜蛋白或糖蛋白的形式存在，蛋白質(zhì)C端區(qū)域通過剪切釋放具有生物學(xué)活性的功能肽。近年來，采用同源克隆和EST等分子生物學(xué)手段，已從虹鱒、金頭鯛(Sparus aurata)、斑馬魚(Danio rerio)、鯉魚、真鯛(Pagrus major)等多個(gè)養(yǎng)殖品種中克隆到TNF-α基因。魚體在脂多糖(LPS)和刀豆蛋白A(ConA)等刺激劑刺激下產(chǎn)生的細(xì)胞因子可以和哺乳動(dòng)物TNF-α進(jìn)行交叉反應(yīng)，并且具有激活巨噬細(xì)胞的生物學(xué)功能。Hirono I等研究認(rèn)為，牙鲆(Paralychthys olivaceus)TNF-α的cDNA序列為TNF-α家族的典型序列。虹鱒體內(nèi)有140 bp的5’UTR，506 bp的3’UTR，739 bp的 開放閱讀框(ORF)，試驗(yàn)證明，在牙鲆的外周血白細(xì)胞和腎臟中都有TNF-α的表達(dá)。 2 單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng) 單核巨噬系統(tǒng)在各組織部位的細(xì)胞，作為一類重要的集吞噬與抗原遞呈作用為一體的細(xì)胞，在聯(lián)系非特異性抗病毒反應(yīng)與特異性抗病毒免疫反應(yīng)中更具有重要意義。它們可以吞噬被病毒感染的細(xì)胞及被病毒破壞的細(xì)胞碎片，經(jīng)酶水解等過程，將病毒抗原分子降解成為小分子肽段，并通過其自身表達(dá)的MHC Ⅱ類分子遞呈于細(xì)胞表面，從而激活特異性T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞反應(yīng)，將抗病毒免疫由非特異性反應(yīng)引入特異性反應(yīng)。它同時(shí)可以利用其吞噬功能，通過表面的多糖受體和Fc受體，非特異的清除組織中的病毒顆粒及病毒感染細(xì)胞。Neurnannl N F等在鯽(Carassius auratus)頭腎細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出形態(tài)、細(xì)胞化學(xué)和殺菌機(jī)制不同的三類巨噬細(xì)胞。魚類的巨噬細(xì)胞不僅具有殺傷細(xì)菌及寄生蟲的作用，而且能夠在受到微生物侵?jǐn)_時(shí)被微生物的有害產(chǎn)物激活。另外，與哺乳動(dòng)物類似，魚類巨噬細(xì)胞執(zhí)行免疫功能和細(xì)胞因子多層次多方面進(jìn)行相互協(xié)同的調(diào)節(jié)。 3 干擾素 IFN系統(tǒng)是脊椎動(dòng)物抵抗病毒入侵的第一道屏障，能在病毒感染后幾小時(shí)內(nèi)迅速起作用，而特異性抗體要在幾天或幾周之后才能由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。根據(jù)來源、序列、活性等方面的區(qū)別，干擾素最初分為兩族，Ⅰ型干擾素和Ⅱ型干素。Ⅰ型干擾素主要包括人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的α、β、ω、κ，以及在反芻動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的τ和在小鼠中發(fā)現(xiàn)的ζ等幾個(gè)亞族。Ⅱ型干擾素只有一種γ干擾素。近年發(fā)現(xiàn)的λ干擾素(IFN-λ)被認(rèn)為是新的一族干擾素。 Gravell等首次發(fā)現(xiàn)傳染性胰腺壞死病毒(IPNV)在23℃ 能誘導(dǎo)黑頭軟頭鰷的鰭傳代細(xì)胞FHM分泌一種類似哺乳類IFN的抗病毒活性物質(zhì)。此后又在多種病毒感染的魚類和魚類培養(yǎng)細(xì)胞中得到證實(shí)，如虹鱒、舌齒鱸(Dicentrarchus labrax)、大麻哈魚(0．keta)、鯉魚、草魚(Ctenopharyngodon idellus)、金魚(Carassius aurattus Li．)、鯽魚、牙鲆等，并發(fā)現(xiàn)魚類IFN至少有兩類：第一類為耐酸(pH 2穩(wěn)定)、耐熱。由病毒或dsRNA等誘導(dǎo)，性質(zhì)與哺乳類I型IFN相似。如病毒性溶血敗血癥病毒(VHSV)和PolyI：C誘導(dǎo)的鮭類IFN都有酸穩(wěn)定性；第二類為不耐酸、不耐熱。由白細(xì)胞、T細(xì)胞或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，由絲分裂素等誘導(dǎo)，與哺乳類Ⅱ型IFN相似。早在1967年，Sigel就指出，魚類IFN可能是魚類特異性免疫反應(yīng)不足的一種補(bǔ)充，水溫較低魚體免疫低下時(shí)，它的合成在抵抗病毒感染中能發(fā)揮重要作用。 3．1 干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白分子 由干擾素誘導(dǎo)的，形成細(xì)胞及機(jī)體抗病毒狀態(tài)的反應(yīng)產(chǎn)物，均是細(xì)胞內(nèi)具有一定功能的蛋白分子，它們各自在細(xì)胞特定生物學(xué)狀態(tài)下執(zhí)行相應(yīng)的生理功能，但當(dāng)它們?cè)诓《炯磳⒏腥镜募?xì)胞內(nèi)形成一個(gè)系統(tǒng)時(shí)，各自的生物學(xué)功能通過整合相加，從而形成一個(gè)具有較大威力的抗病毒狀態(tài)。這些蛋白分子中，蛋白激酶PKR、Mx蛋白、主要組織相容性抗原、一氧化氮合成酶(NOS)在魚類中已有研究。 3．1．1 蛋白激酶 蛋白激酶(PKR)是一類可由干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生、RNA依賴的絲氨酸蛋白激酶。在干擾素處理的細(xì)胞中，PKR主要出現(xiàn)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并與核糖體相連，細(xì)胞核內(nèi)也可見到小量的PKR存在。PKR作為抗病毒因子的基本機(jī)理，是其對(duì)病毒mRNA翻譯環(huán)節(jié)的抑制。通常直接激活PKR的是雙鏈形式的RNA，它使PKR 自動(dòng)發(fā)生磷酸化。活化后的PKR至少可使6個(gè)蛋白質(zhì)分子內(nèi)的磷酸化過程被催化。胡成鈺等根據(jù)鯽魚類PKR蛋白激酶基因(CaPKR-like)的全長(zhǎng)cDNA序列，克隆CaPKR-like Zα結(jié)構(gòu)域cDNA，表明CaPKR-like蛋白在病毒感染的細(xì)胞中很可能也能結(jié)合dsRNA，并形成二聚體，行使類似哺乳類PKR的各種生理功能。 3．1．2 GTPase的活性的Mx蛋白 干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞蛋白中，對(duì)包括MxA和Mx1的Mx蛋白家族認(rèn)識(shí)比較充分。動(dòng)物試驗(yàn)和細(xì)胞水平上的分析，都已充分肯定了Mx蛋白對(duì)病毒增殖過程的有效阻滯，它的特點(diǎn)是不需要其他干擾素誘導(dǎo)成分的輔助，自身就可以表現(xiàn)抗病毒活性。這個(gè)蛋白事實(shí)上是屬于類動(dòng)力蛋白GTPase的超家族成員，而且此酶的活性本身就是抗病毒活性所需。 利用Poly I：C及病毒在虹鱒、大西洋鮭、牙鲆以及魚類細(xì)胞系RTG22、CHSE2214等都能成功誘導(dǎo)Mx蛋白或Mx、mRNA的表達(dá)。虹鱒的3個(gè)Mx基因、大西洋鮭3個(gè)Mx基因以及牙鲆Mx和cDNA都已經(jīng)成功克隆。所有魚類Mx都具有脊椎Mx蛋白的結(jié)構(gòu)特征，包含一個(gè)三聯(lián)體GTP結(jié)合區(qū)域，在MX蛋白的C端有高度保守的Leu拉鏈。向虹鱒肌肉注射包含編碼病毒VHSV糖蛋白基因的質(zhì)粒進(jìn)行DNA免疫，除了能產(chǎn)生很強(qiáng)的激素應(yīng)答反應(yīng)外，還能激活機(jī)體特異性或非特異性的抗病毒機(jī)制，其中Mx和mRNA強(qiáng)烈表達(dá)。天然野天村病毒感染鯰魚可以顯著的上調(diào)Mx和mRNA在所有組織中的表達(dá)。進(jìn)一步研究表明，DNA免疫虹蹲，在早期可能是誘導(dǎo)魚體非特異性的抗病毒機(jī)制，由Ⅰ型IFN介導(dǎo)初步保護(hù)；較長(zhǎng)期的保護(hù)則是誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)免疫基因(如病毒糖蛋白基因)特異性的抗病毒反應(yīng)。同樣，所有經(jīng)編碼病毒糖蛋白基因免疫的虹鱒均能從腎和肝檢測(cè)到高濃度的Mx蛋白，表明Mx蛋白的表達(dá)與魚體的抗病毒機(jī)制有一定的相關(guān)性。 3．1．3 主要組織相容性抗原 主要組織相容性抗原是非特異性免疫系統(tǒng)中極其復(fù)雜和最具多態(tài)性的一類分子?？煞譃榻Y(jié)構(gòu)上和功能上都不同的Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類(Ⅲ類為補(bǔ)體系統(tǒng)的成分)。其中Ⅰ類和Ⅱ類抗原分子均是表達(dá)在細(xì)胞表面的穿膜型糖蛋白，各由兩條不同的多肽鏈借非共價(jià)鍵組成異二聚體結(jié)構(gòu)，其共性是具有抗原多肽結(jié)合區(qū)。魚類主要組織相容性抗原包括MHCⅠ類分子和MHCⅡ類分子。近年來已從鯉、大西洋鮭、斑馬魚、虹鱒等多種魚類中克隆MHCⅠ類分子和Ⅱ類分子基因，二者具有獨(dú)立的免疫學(xué)應(yīng)答。魚類MHC分子的成功分離和純化，證明與其他物種(如哺乳動(dòng)物)MHC分子具有高度的同源性，并顯示其與免疫球蛋白(Ig)超家族可變族高度相似。 3．1．4 誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶 干擾素誘導(dǎo)的一氧化氮合成酶(NOS)是一類催化依賴于NADPH氧化L-精氨酸產(chǎn)生一氧化氮和胍氨酸的酶，它包括同屬一個(gè)家族的3個(gè)同工酶，即NOS，神經(jīng)細(xì)胞NOS和內(nèi)皮細(xì)胞NOS。NOS可以增加一氧化氮的產(chǎn)生，后者可以激活巨噬細(xì)胞的功能，使其在天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。Saeij J P等用鰷魚的NOS寡核苷酸序列作為引物，擴(kuò)增出了鯽的NOS cDNA文庫(kù)，序列數(shù)據(jù)中有57%和人的NOS相同。用鮭魚菌(Renibacterium salmoninarumv)經(jīng)注射或浸泡方法處理虹鱒后，在其鰓和頭腎中均發(fā)現(xiàn)有NOS的表達(dá)，在魚類中已經(jīng)確認(rèn)巨噬細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)NOS的活性，還證明在魚類體內(nèi)存在的NOS激活機(jī)制和哺乳動(dòng)物的類似。 近40年來的研究認(rèn)為，魚類存在IFN系統(tǒng)的證據(jù)，主要來自對(duì)病毒誘導(dǎo)的培養(yǎng)細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)的具有類似哺乳類IFN的抗病毒活性物質(zhì)，但是，直到今天，也沒有成功純化出任何一種魚類IFN蛋白。 3．2 干擾素誘導(dǎo)的抗病毒機(jī)制 IFN誘導(dǎo)的抗病毒機(jī)制主要有3條途徑，即PKR(依賴dsRNA 的蛋白激酶途徑)、2-5A合成酶途徑和Mx蛋白質(zhì)途徑。PKR是一類由病毒雙鏈RNA激活的激酶，能磷酸化真核起始因子2(eIF2)，最后導(dǎo)致對(duì)病毒和細(xì)胞蛋白合成的抑制。2-5A合成酶被病毒雙鏈RNA激活后，將ATP轉(zhuǎn)化為2’，5’-環(huán)狀寡聚腺苷酸，后者激活核酸酶L(RNase L)，降解病毒和細(xì)胞mRNA。Mx蛋白屬于動(dòng)力蛋白家族的GTP酶，據(jù)推測(cè)其通過抑制病毒核衣殼在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移而抑制病毒的復(fù)制。 最近魚類IFN系統(tǒng)基因的鑒定和克隆取得了重大進(jìn)展，不僅有IFN基因，而且還包括參與IFN信號(hào)通路、表達(dá)調(diào)控及IFN誘導(dǎo)的具有抗病毒功能的ISG。在IFN誘導(dǎo)細(xì)胞抗病毒狀態(tài)之前加入微量ActD，可使IFN的抗病毒作用消失，表明魚類IFN對(duì)病毒的抑制作用是通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯水平的調(diào)控來完成的，依賴于細(xì)胞內(nèi)RNA和蛋白質(zhì)的合成。在同種細(xì)胞上，魚類IFN具有廣譜抗病毒活性，對(duì)魚類和非魚類病毒、RNA 和DNA 病毒都有抑制作用。 4 結(jié)語(yǔ) 在病毒感染早期，除病毒抗原誘發(fā)的少量抗體的中和作用外，非特異性免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，隨著病毒感染程度的深入，細(xì)胞免疫不斷強(qiáng)化才能清除病毒。病毒致病可能通過dsRNA和PKR的激活抑制宿主蛋白表達(dá)，也與復(fù)制過程中mRNA引物的使用導(dǎo)致宿主mRNA降解有關(guān)。在病毒與宿主細(xì)胞相互作用制約的感染過程中，病毒能夠利用其特殊的病毒編碼產(chǎn)物干擾和頡頏宿主免疫反應(yīng)，使病毒能長(zhǎng)期生存。在控制病毒性疾病過程中病毒疫苗發(fā)揮重要作用，盡管在病毒疫苗研制領(lǐng)域中，還有各種技術(shù)問題需要進(jìn)一步的探索，但是近年所面臨的是對(duì)病毒與宿主細(xì)胞及機(jī)體之間的關(guān)系知之甚少。因此，加強(qiáng)對(duì)病毒與細(xì)胞、機(jī)體的相互關(guān)系的研究，是提升防治病毒性疾病整體技術(shù)能力的基礎(chǔ)。 （參考文獻(xiàn)） （信息來源：《動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展》2008.5） |
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