背景：在過去10年間靶向療法顯著改變了癌癥的治療。但是，由于腫瘤異質(zhì)性、克隆進化和選擇問題，幾乎所有腫瘤都會對系統(tǒng)治療產(chǎn)生抗性。雖然基因分型目前被廣泛用于腫瘤分類以進行臨床決策，但是腫瘤組織只提供了點滴信息，或者通常難以獲得。為了克服這些問題，需要一些方法在病程期間各個時間點鑒別生物標志物；鑒別不僅要快速，成本效益高，還要非侵入性。因為無細胞循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）可能代替整個腫瘤基因組，ctDNA用作液體切片可能有助于獲得急需的遺傳隨訪數(shù)據(jù)。
內(nèi)容：本文包含了近期探索ctDNA作為液體切片在癌癥中的潛在診斷、預后和預測作用的研究。另外，還涵蓋了生物學和技術(shù)層面，包括DNA分析的分析靈敏度和準確度最新進展以及在臨床常規(guī)實踐中實施之前必須克服的障礙。
總結(jié)：雖然ctDNA分析是一個有前景的領(lǐng)域，而且為了開發(fā)適當工具全面分析血漿DNA腫瘤基因組做出了所有努力，液體切片仍未在臨床常規(guī)應用。需要達到分析前和分析程序一致性，以提供臨床標準在精心設(shè)計和足夠權(quán)威的多中心研究中確認液體切片可以作為臨床生物標志物。
很多癌癥類型的臨床后果可以通過鑒別其發(fā)病機理之下的分子事件來改善。通過使用所謂的生物標志物，根據(jù)腫瘤的遺傳組成調(diào)整治療方法。腫瘤基因分型是一種通過對腫瘤分類做出臨床決策的可能方法，而且可能鑒別出對多種藥物反應的患者。
近期，新的生物標志物發(fā)現(xiàn)獲得了實質(zhì)性的進展，比如表皮生長因子受體（EGFR）和鼠類肉瘤病毒癌基因（KRAS）激活突變以及v-erb-b2鳥類成紅細胞白血病病毒癌基因2（ERBB2）和棘皮動物微管相關(guān)類蛋白4與間變性淋巴瘤激酶（EML4–ALK）融合基因擴增。包含這些突變的癌癥對特異性靶向抑制劑敏感。由于大規(guī)模癌癥基因組測序研究以空前的速度闡明了新型癌癥相關(guān)突變，并且我們對于這些遺傳學改變的功能后果的了解快速增加，更多的生物標志物將出現(xiàn)。
盡管在過去10年間靶向療法顯著改變了癌癥的治療，但是這些療法帶來了一些新的問題和挑戰(zhàn)，包括腫瘤異質(zhì)性和分子進化、活檢（切片）的費用和潛在發(fā)病、大多數(shù)基因組變異缺乏有效藥物、分析試驗的技術(shù)局限性、報銷和法規(guī)阻礙。其中最重要的生物學問題之一是瘤內(nèi)異質(zhì)性。由于腫瘤異質(zhì)性、克隆進化和選擇問題，不管用何種療法，幾乎所有腫瘤都會產(chǎn)生抗性。Gerlinger等人在多腫瘤抑制基因中發(fā)現(xiàn)極大的異質(zhì)性，這可能會造成影響，尤其是對同期轉(zhuǎn)移癌患者，因為在大多數(shù)情況下，只能做活檢而且治療決策取決于單個腫瘤活檢的結(jié)果。因此，可能忽略相關(guān)病變（圖1）。此外，在大多數(shù)情況下活檢難以獲得，無法獲得轉(zhuǎn)移瘤的遺傳組成信息。因此，治療決策常常是在不知道腫瘤遺傳組成的情況下做出的（圖1）。另外，腫瘤會進化并且在進展期間可能出現(xiàn)亞克隆，從而導致原發(fā)腫瘤與轉(zhuǎn)移瘤或復發(fā)瘤之間的特異性變異比例和模式差異。此外，研究表明轉(zhuǎn)移瘤不一定比其原發(fā)腫瘤復雜，例如，轉(zhuǎn)移瘤可能失去原發(fā)病變存在的變異（圖1）。由于腫瘤存在極大的異質(zhì)性而且我們?nèi)狈δ[瘤遺傳組成的認識，原發(fā)性耐藥或繼發(fā)性耐藥的原因尚不清楚。因而，既然治療相關(guān)標志物在腫瘤進展期間可能改變，那么多個時間點的標志物研究可能提供關(guān)于患者管理的重要信息（圖1和2）。對腫瘤基因組進行連續(xù)采樣來監(jiān)測治療效果應該是個體化治療的先決條件；然而，由于連續(xù)活檢對于患者來說通常是一種負擔，因為活檢具有侵入性，所以這種做法目前幾乎是不可行的。另外，有人提出某些活檢會使腫瘤播散，但是這是非常罕見的事件?？偠灾?，雖然無創(chuàng)程序可能帶來潛在風險，但是當前的替代治療方案具有不可接受的毒性而且將進行性疾病基于通常不是非常準確的臨床參數(shù)，即放射學影像和/或測量。
為了克服這些問題，需要一些方法在病程期間各個時間點（在診斷，和治療期間的確定區(qū)間）鑒別生物標志物；鑒別不僅要快速，成本效益高，還要非侵入性?？朔貜筒蓸泳窒扌缘囊粋€方法是分析循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）和/或無細胞循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）。近期有關(guān)ctDNA和CTC分析的進展能夠通過無創(chuàng)手段監(jiān)測腫瘤基因組。多項研究表明可以重建血漿NDA的腫瘤基因組。腫瘤細胞將DNA片段釋放到循環(huán)中，這些片段和正常細胞的DNA片段[無細胞DNA（cfDNA）]都可以在血液的無細胞部分發(fā)現(xiàn)。由于ctDNA可能代替整個腫瘤基因組，所以它被稱為“液體切片”。因為最佳治療管理傾向于在整個腫瘤基因組的現(xiàn)狀基礎(chǔ)上做出決策，ctDNA用作液體切片可能有助于獲得急需的遺傳隨訪數(shù)據(jù)。本文涵蓋了生物學和技術(shù)層面，以及cfDNA對癌癥診斷學產(chǎn)生廣泛影響的挑戰(zhàn)。由于這是一個不斷發(fā)展的領(lǐng)域而且cfDNA的數(shù)據(jù)很多，我們不能包括這個特殊領(lǐng)域的所有現(xiàn)存研究。
圖1：液體切片用于監(jiān)測治療效果和抗性
假設(shè)一名轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的病程。一線治療基于原發(fā)腫瘤的活檢，相關(guān)轉(zhuǎn)移變化可能漏掉從而導致原發(fā)耐藥。轉(zhuǎn)換成二線治療后，繼發(fā)耐藥出現(xiàn)?？梢杂靡后w切片分析抗性克隆的遺傳變化，因此在臨床進展顯著之前可能發(fā)現(xiàn)耐藥機制。
圖2：液體切片用于監(jiān)測腫瘤特異性變異以檢測復發(fā)
假設(shè)一名乳腺癌患者的病程。原發(fā)腫瘤治療切除后，很長一段時間可能沒有臨床疾病證據(jù)。但是，可能在臨床發(fā)現(xiàn)腫瘤復發(fā)之前很久就在循環(huán)中檢測到腫瘤特異性DNA。另外，腫瘤特異性變化可用于鑒別高危復發(fā)患者。
無細胞DNA通過凋亡或壞死細胞的多種機制，從不同的腫瘤部位和健康/炎性組織釋放出來。腫瘤來源DNA（ctDNA）可從血漿中提取出來而且各種腫瘤特異性遺傳變化可被檢測到。但是，腫瘤特異性DNA的數(shù)量變化相當大（從<1%到>90%），很多ctDNA分析技術(shù)被提出。液體切片可在各種臨床情況下應用，包括癌癥診斷、最小殘留疾病檢測、預后和治療監(jiān)測。WGS，全基因組測序。
生物學層面
cfDNA最初由Mandel和Me′tais在健康個體的血液中發(fā)現(xiàn)。但是，他們的創(chuàng)舉沒有引起充分注意，直到30年后Leon等人報道了癌癥患者血液循環(huán)中cfDNA的濃度增加。又過了10年后，Stroun等人證明了血液循環(huán)中存在腫瘤特征。這些發(fā)現(xiàn)后來得到其他一些研究小組證實，隨后這些年腫瘤特異性變異，包括腫瘤抑制基因和致癌基因、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）、和DNA甲基化分別被鑒別出來；它們提供了確鑿的證明，表明cfDNA通過腫瘤釋放到血液循環(huán)中（圖3）。
幾乎沒有cfDNA釋放到血液循環(huán)的實際動力學數(shù)據(jù)，對其來源、機理和釋放速率的認識通常也是矛盾的。cfDNA被認為有不同來源，包括凋亡和壞死細胞（圖3）。有些報道表明腫瘤的惡性質(zhì)導致更大程度的壞死，這與循環(huán)腫瘤DNA增加是一致的。Diehl等人認為在血液循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的DNA片段來源于被巨噬細胞吞噬的壞死腫瘤細胞。最近Sikora等人的一項研究顯示，在胰腺導管腺癌、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤和慢性胰腺炎患者中幾乎檢測不到較大的壞死來源的DNA片段。或者，所有活細胞主動釋放DNA到血液循環(huán)中。然而，Lo等人利用孕婦血漿DNA的全基因組測序，證明了血漿DNA分子表現(xiàn)出可預測的裂解（片段化）規(guī)律，使人聯(lián)想到核酸酶裂解的核小體。通過評估cfDNA在健康個體和癌癥患者中的大小分布證明了這一發(fā)現(xiàn)，評估揭示了單個或多個核蛋白復合體大小的片段富集和釋放的主要原因可能是細胞凋亡（圖4）。從小鼠實驗獲得更多細胞凋亡作為cfDNA主要來源的證據(jù)，結(jié)果表明移植瘤動物血漿中的主要片段來源于單核小體。作者證明了ctDNA特征在裸鼠（被移植了人CRC細胞系HT29或SW620）的結(jié)腸直腸癌（CRC）腫瘤生成期間不斷變化。雖然ctDNA在早期已經(jīng)可以檢測到，但是最終腫瘤的大小與可檢測到的cfDNA濃度沒有顯著相關(guān)性。Mouliere等人對cfDNA的大小分布做了深入研究，結(jié)果顯示移植瘤小鼠和癌癥血漿樣品中腫瘤來源的ctDNA具有特定的ctDNA大小分布圖和明顯較高的ctDNA片段化。這一發(fā)現(xiàn)被Garcia-Olmo等人的研究證實，他們證明了釋放到血漿中的正常和腫瘤DNA似乎與個體特異性因素相關(guān)，腫瘤DNA對突變和非突變DNA濃度的影響隨著時間波動。同一研究小組提出血漿中的cfDNA可能參與腫瘤形成，和通過易感細胞類轉(zhuǎn)染（transfection-like）吸收這些核酸形成轉(zhuǎn)移瘤的過程。補充KRAS突變患者的血漿導致鼠科NIH-3T3的致癌性轉(zhuǎn)化，這個過程稱之為基因組轉(zhuǎn)移（genometastasis）。近期一項研究介紹了用原子力顯微技術(shù)首次目視測定 CRC患者和健康獻血者血漿樣品的cfDNA ，結(jié)果又顯示CRC血漿中80%以上的cfDNA片段都低于145bp，證實了通過凋亡機制產(chǎn)生很高程度的片段化。
圖3：液體切片用作癌癥監(jiān)測工具的圖示
此外，關(guān)于cfDNA穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)更少；但是，清除機制似乎很快，脾、肝和腎可能負責清除。據(jù)先前估算無細胞胎兒DNA（cffDNA）的半衰期是16分鐘；不過，同一研究小組近期利用大規(guī)模平行測序（MPS）技術(shù)研究了cffDNA的動力學，結(jié)果顯示在兩階段清除過程中，快速階段的半衰期大約為1小時，第二階段為13小時。使用MPS評估cfDNA的釋放和清除動力學從兩個方面來說對靶向療法有益。首先，可以使用整個基因組，因此MPS不依賴于包含特異性基因位點的DNA片段。其次，MPS能夠檢測所有循環(huán)DNA片段，不管大小如何。然而，對癌癥患者的血漿DNA清除機制所知不多，也不知道其他因素比如生物周期節(jié)律、炎癥或特殊療法如何影響釋放和清除機制。循環(huán)Epstein–Barr病毒（EBV）DNA研究首先發(fā)現(xiàn)了等效機制的證據(jù)。
技術(shù)層面
由于片段化程度高和血液循環(huán)中濃度低，cfDNA是一種具有很大挑戰(zhàn)的分析物。雖然如此，已證明血漿是比血清更好的cfDNA分析來源，但是血清比血漿中的cfDNA量高2-24倍。這主要是由于在凝血過程中受到細胞污染，因此很多實驗室推薦使用血漿作為分析腫瘤特異性DNA的來源，原因是背景野生型DNA的濃度更低。雖然絕大多數(shù)研究表明癌癥中cfDNA濃度較高，但是目前還不能評估患者循環(huán)中cfDNA的癌癥特異性程度，因為cfDNA濃度增加也可以在生理學和非癌病理學情況下檢測到。相比之下，在比較血漿和血清樣品數(shù)據(jù)時，觀察到健康個體和癌癥患者存在明顯的重疊。
較高濃度的cfDNA似乎仍然反映癌癥患者的體內(nèi)情況。在考慮將cfDNA濃度作為信息性診斷生物標志物之前，需要解決各種問題。第一，分析前程序需要標準化。有些研究涉及血液處理方法，包括接收樣品和開始分離程序之間的間隔時間、離心條件和使用了血清還是血漿。選擇確保提取足夠多高質(zhì)量DNA的分離方法很關(guān)鍵，結(jié)果表明血液采集和處理的分析前因素能夠嚴重影響DNA含量。因為很多傳統(tǒng)cfDNA分離方法費用昂貴、耗時長且復雜，Sonnenberg等人發(fā)明了新型電動學技術(shù)，能夠直接從血液中快速分離cfDNA。第二，最重要的問題之一是定量方法缺乏一致性（harmonization）。不同的定量方法，包括分光光度法、熒光染料和定量PCR方法會產(chǎn)生差異結(jié)果，因為這些測量要么靶定總DNA要么只靶定擴增DNA。近來，Devonshire等人比較了7種不同參照基因試驗的定量PCR測量。他們觀察到與端粒相鄰的位點比更接近著絲粒的位點豐富，證明了測量單一基因位點容易出現(xiàn)偏移（bias）。ctDNA定量尤其是這樣，因為腫瘤發(fā)生各種拷貝數(shù)變化。其他方法則從血漿直接進行cfDNA定量，先前不做DNA分離。第三，對cfDNA釋放的來源和詳細機制所知甚少，而且大多數(shù)研究表明混淆事件也可能引起cfDNA釋放，例如非惡性疾病、癮君子、孕婦、鍛煉和心功能不全，但卻沒有被納入考慮。
因此，就可靠有效的cfDNA定量和分析方法達成共識至關(guān)重要，從而在臨床上評估ctDNA作為液體切片是否能夠獲得可在不同實驗室間相比較的更加一致的數(shù)據(jù)。
液體切片的臨床使用
液體切片在臨床中的應用是多方面的，因為使用血液的液體切片概念代表一種有用的工具，可以找出整個病程期間的腫瘤特異性變化（圖3，表1）。液體切片可用于鑒別疾病復發(fā)以及疾病進展的替代指標，能夠指出特定治療是否適用或者是否能降低復發(fā)或進展的風險。
圖4：健康個體和癌癥患者的血漿DNA樣品的大小分布
所有樣品都顯示了對應于核小體DNA的166bp片段富集，表明細胞凋亡是循環(huán)中DNA釋放的主要原因。在患者亞組中也觀察到更大的片段。
表1：液體切片的臨床應用
cfDNA作為診斷生物標志物
臨床上最早將cfDNA用作液體切片，是專注于簡單地定量評估循環(huán)中的DNA濃度。有些研究報道表示從健康個體、良性疾病患者和癌癥患者分離的血漿DNA數(shù)量存在顯著差異。雖然一些研究揭示癌癥患者的cfDNA濃度明顯較高而且簡單的cfDNA定量可以證實存在癌癥或無疾病狀態(tài)和治愈手術(shù)后的復發(fā)，但是許多其他研究也證明了只有cfDNA數(shù)量不是有用的診斷工具并且在不知道腫瘤突變的情況下cfDNA的效用受限。一項研究分析了CRC患者的總血漿DNA濃度和腫瘤特異性KRAS突變，結(jié)果表明數(shù)量更高的腫瘤特異性片段和數(shù)量更多的CTCs與血漿DNA片段的兩階段大小分布有關(guān)（圖4）。然而，盡管處于腫瘤晚期，并不是所有患者的循環(huán)中都可以檢測到ctDNA濃度。這一發(fā)現(xiàn)被Bettegowda等人近期的研究證實。Madhavan等人評估了一個較大乳腺癌患者群體（n=383）和一組健康對照（n=100）的cfDNA完整性。從健康對照到局限性疾病患者再到轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，觀察到cfDNA完整性分層降低和cfDNA濃度增加。另外一項研究表明所有被分析的CRC患者在手術(shù)時血漿和血清的cfDNA濃度都較高（定量方法），只有約37%的病例發(fā)生癌胚抗原值改變。
盡管簡單的cfDNA定量可能對診斷和預后估計沒用，但是監(jiān)測腫瘤特異性變化可能是早期癌癥檢測和/或預后的有用工具。不過，腫瘤來源的循環(huán)DNA分數(shù)達到0.01%-≥90%范圍，代表進一步的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。在某些臨床情況下cfDNA濃度低于突變的最佳檢測值。因此，將ctDNA用作診斷工具和用于檢測最小殘留疾病，需要高度特異性的標志物和分離靈敏度高的技術(shù)。
對于實體瘤采取的一個方法是檢測復發(fā)體細胞重排，就像以前監(jiān)測白血病的殘留疾病負擔。McBride等人繪制出了3名患者的基因組重排圖，結(jié)果顯示重排PCR試驗可以檢測到血漿中腫瘤基因組的單一拷貝且沒有假陽性。應該注意到并不是腫瘤的所有重排都真實參與了腫瘤形成或進展，有些過客重排（passenger rearrangements）可能在復發(fā)克隆或轉(zhuǎn)移時丟失了。最新報道的診斷方法有血液CRC篩查試驗，使用SEPT9（septin 9）生物標志物特異性檢測所有階段和結(jié)腸直腸部位的大多數(shù)CRCs，或者使用血漿EBV DNA分析對沒有臨床懷疑的個體進行鼻咽癌早期檢測。
ctDNA用作預后生物標志物
Lecomte等人的研究關(guān)注CRC患者的KRAS熱點突變和周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A（CDKN2A）高度甲基化。他們證明了沒有發(fā)現(xiàn)ctDNA的患者2年存活率是100%，這些患者具有KRAS突變或CDKN2A基因啟動子高度甲基化，分別見于40%或20%-50%的CRC患者，表明了對這些標志物的預后價值。因此，血漿中存在ctDNA似乎是CRC患者的相關(guān)預后標志物，可用于鑒別高危復發(fā)患者（圖2）。這些發(fā)現(xiàn)也被Diehl等人的研究證實，研究表明手術(shù)后可檢測到ctDNA的患者一般在1年內(nèi)復發(fā)。此外，結(jié)果顯示高濃度cfDNA和突變KRAS是轉(zhuǎn)移性CRC患者不良預后的明確指標。乳腺癌患者的研究報告了相似數(shù)據(jù)。不僅如此，近期研究表明在聯(lián)合分析ctDNA和CTCs的腫瘤特異性突變時ctDNA似乎是比CTC更好的預后標志物。晚期非小細胞肺癌患者的研究獲得了相似的結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)對于突變檢測ctDNA分析比CTCs的靈敏度更高，而且檢測到的突變與匹配腫瘤的突變狀態(tài)有很高的一致性。
ctDNA用作預測生物標志物
液體切片最廣泛和重要的應用之一是監(jiān)測治療效果，尤其是側(cè)重于具有已知耐藥機制的療法。KRAS野生型結(jié)腸直腸瘤通常對EGFR阻斷劑敏感，但是幾乎所有患者會在數(shù)月內(nèi)產(chǎn)生抗性。液體切片避免了重復治療后腫瘤組織采樣的障礙，而且可提供腫瘤病變內(nèi)或各種腫瘤病變間的綜合信息。
近期一項研究表明循環(huán)cfDNA能夠更好地整體代表惡性疾病，是診斷DNA的可靠來源，可能代替腫瘤組織在診斷方面的應用。2012年Diaz等人檢驗了在接受帕尼單抗單一療法的CRC患者的血液循環(huán)中是否能檢測到突變KRAS DNA。治療后5-6個月期間38%的患者血清中檢測到KRAS突變。另一項研究分析了在應用靶向療法之前的轉(zhuǎn)移性CRC患者，結(jié)果顯示對B-Raf原癌基因絲氨酸/蘇氨酸激酶（BRAF）V600E突變的診斷特異性和靈敏度均是100%，對7種被檢測KRAS點突變的特異性和靈敏度分別是98%和92%。有趣的是，突變等位基因的數(shù)量在突變樣品間高度變化（0.5%–64.1%，中值10.5%）。有些研究報道了對抗EGFR療法產(chǎn)生抗性與獲得性KRAS突變有關(guān)，發(fā)生新的局部擴增或高水平染色體12p多染色體，而且循環(huán)中的抗性克隆在臨床進展明顯之前數(shù)月可檢測到。另外，近期證明了其他基因的局部擴增也與抗EGFR療法獲得性耐藥有關(guān)，比如MET原癌基因受體絡(luò)氨酸激酶（MET）和ERBB2。EGFR基因比例過高與良好的初始抗EGFR療效有關(guān)。
方法學層面
一般來說，有兩種血漿DNA分析方法（圖3）。第一種是靶向方法，包括對原發(fā)腫瘤一小組常發(fā)驅(qū)動基因突變的已知遺傳變化分析，比如KRAS或EGFR突變，這對治療決策有意義。第二種是非靶向方法，不知道原發(fā)腫瘤的任何特異性變化。ctDNA基因組分析可用于在疾病監(jiān)測、分子抗性檢測和新治療靶標鑒別的情況下發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性變異。比全基因組測序成本效益更高的方法是外顯子組測序，也不需要知道腫瘤的遺傳圖譜。
液體切片分析的靶向方法
cfDNA體細胞點突變的鑒別發(fā)表于1994年。至此以后，很多研究都分析了血漿和血清中的已知腫瘤特異性變化。隨著技術(shù)進步，近年來檢測的分析靈敏度大幅升高，新技術(shù)包括ARMS（擴增受阻突變系統(tǒng)）、數(shù)字PCR（dPCR）和微珠-乳劑-擴增-磁學（BEAMing）能夠鑒別特低頻的突變等位基因。Newman等人介紹了癌癥個體化深度測序分析方法（CAPP-Seq），使用這種方法對ctDNA定量既經(jīng)濟又超靈敏。該方法結(jié)合了最佳化低輸入DNA文庫制備方法與多階段（多相）生物信息方法，設(shè)計了一種“選擇器”，包含靶定癌癥循環(huán)突變域的生物素化寡核苷酸。在所有II–IV期和50%I期的非小細胞肺癌患者中檢測到ctDNA，診斷特異性從突變等位基因片段的96%下降到預定突變的約0.02%。ctDNA濃度與腫瘤體積高度相關(guān)，能夠區(qū)分殘留疾病與治療相關(guān)影像學變化。另外，ctDNA濃度測量比放射方法能更快評估療效。Bettesgowda等人最新的研究分析了具有不同腫瘤疾病和腫瘤分期的一個大癌癥患者群體。ctDNA對于檢測臨床相關(guān)KRAS基因突變的診斷靈敏度是87.2%，特異性99.2%。但是，他們使用了高度靈敏的分析方法包括dPCR和安全測序系統(tǒng)（Safe-SeqS）方法。Safe-SeqS是同一個研究小組先前建立的，能夠有效檢測極低水平的腫瘤特異性突變，通過使假定測序誤差降低至少70倍與背景信號進行明確區(qū)分。Bettesgowda等人的研究表明Safe-SeqS能夠檢測出5mL血漿的一個DNA突變模板。此外，作者篩查了高度腫瘤特異性易位，可用于檢測極低水平的腫瘤特異性變化以鑒別最小的殘留疾病。
雖然如此，大多數(shù)這些方法只靶定少數(shù)位點，而錯過了缺少突變熱點的基因突變比如腫瘤抑制基因。將沒有熱點的驅(qū)動基因包含在內(nèi)的一個可能是選定基因（已知與腫瘤形成和進展有關(guān)）的靶定測序。我們的一項研究在常見于易位的染色體區(qū)域定向富集后直接從血漿中成功鑒別出結(jié)構(gòu)性重排。超過4000例腫瘤樣品的綜合分析，包括來自癌癥基因組圖譜（TCGA）和獨立的、非TCGA群體的3600多個數(shù)據(jù)集，顯示10個腫瘤疾病的全發(fā)生率是76%，一組25個選定基因中至少有一個突變可以被鑒別出來。然而，相當大基因組區(qū)域或較少毫微克cfDNA片段模板的低頻等位基因突變的鑒別更有挑戰(zhàn)性。為了捕獲血漿中的腫瘤特異性突變，F(xiàn)orshew等人建立了所謂的標記擴增子深度測序（TAm-Seq），包括5995個低頻突變基因組庫。使用這種方法，研究者鑒別出等位基因頻率低至2%的癌癥特異性突變，診斷靈敏度和特異性均>97%。較小的已知突變篩查能達到約0.2%的檢測限。
液體切片分析的非靶向方法
液體切片基因組分析的主要優(yōu)勢在于這種方法適用于所有患者，因為它不依賴于復發(fā)遺傳變化。雖然我們的研究表明可以用微陣列比較基因組雜交（array-CGH）分析血漿的基因組拷貝數(shù)，但是NGS方法能夠增加cfDNA拷貝數(shù)分析的分辨率（resolution）。Dennis Lo研究小組是第一個建立血漿基因組分析的，他們進一步發(fā)明了這種技術(shù)，綜合評估低甲基化和癌癥相關(guān)拷貝數(shù)變異。作者表示腫瘤相關(guān)拷貝數(shù)變化（CNAs）也可以通過亞硫酸鹽DNA測序數(shù)據(jù)確定，可用于檢測非轉(zhuǎn)移性癌癥病例。血漿低甲基化的診斷靈敏度和特異性分別為74%和94%。測序深度降低到1千萬序列（reads）對靈敏度和特異性沒有不良影響。我們的研究小組證明臺式MiSeq測序平臺（Illumina）生成的4百萬序列即能可靠檢測到CNAs。Leary等人建立了一種全基因組測序方法，稱之為重排末端個體化分析（PARE），以鑒別實體瘤易位并將這種方法應用到血漿DNA樣品，通過這種方法他們鑒別出一些染色體拷貝數(shù)變化和重排，包括癌癥驅(qū)動基因擴增比如ERBB2和周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）。因為大多數(shù)癌癥包含不太可能存在于正常細胞的多重染色體變異，這是一種高度特異性方法。但是，相似地，Thierry等人研究了范圍在0.5%-64.1%的突變等位基因，該研究中循環(huán)腫瘤DNA的濃度變化巨大，從1.4%到47.9%。Murtaza等人對血漿DNA樣品進行了外顯子組測序并關(guān)注了多個療程。對血漿中等位基因分數(shù)定量鑒別出與療法抗性相關(guān)的突變等位基因增加。作者總結(jié)道，循環(huán)腫瘤DNA的外顯子組分析是對當前侵入性活檢方法的補充，以鑒別與晚期癌癥獲得性耐藥相關(guān)的突變。
Dawson等人近期報道了，使用全基因組測序與個體化試驗相結(jié)合來量化連續(xù)收集的轉(zhuǎn)移性乳腺癌血漿樣品的循環(huán)腫瘤DNA。在用全基因組測序確定患者特異性突變后，將這些突變用于評估連續(xù)樣品的ctDNA濃度。研究者發(fā)現(xiàn)與CA15-3（糖類抗原）或循環(huán)腫瘤細胞相比，突變ctDNA濃度呈現(xiàn)更廣的動態(tài)范圍和與腫瘤負荷變化的更大相關(guān)性。與其他研究相似，這種方法的主要局限性在于需要提前知道變異 – 不管是結(jié)構(gòu)性的還是核苷酸水平的 – 來設(shè)計一個個體化試驗。另一個研究小組利用Affymetrix SNP 6.0陣列分析65例乳腺癌患者的CNAs和雜合性丟失（LOH）。他們發(fā)現(xiàn)配對腫瘤存在局部高水平DNA擴增而且cfDNA在很多染色體臂聚集成群，其中一些包含具有致癌可能的基因。引人注目的是，在50名患者的隨訪樣品中，原發(fā)腫瘤已經(jīng)存在的特異性CNAs在cfDNA中檢測到，但是在診斷后12年都沒有其他疾病證據(jù)。這表明非侵入性方法可用于隨訪期間檢測患者的蟄伏/最小殘留疾病。
基因組方法的缺點之一是缺乏分析靈敏度，雖然已經(jīng)盡很大努力降低MPS誤差率來改善檢測限（經(jīng)過近期提出的雙重法例證），但是這些方法均尚未用于綜合分析血漿的腫瘤基因組（圖3）。盡管如此，仍有很多非侵入性方法可以分析腫瘤，只是不知道哪個方法是最好的?？截悢?shù)分析低覆蓋測序方法一方面能夠快速提供臨床相關(guān)信息且成本效益高；另一方面，這些方法缺乏分析靈敏度，不能檢測核苷酸水平的突變。但是，目前增加深度仍然意味著增加成本和時間，這對于實際臨床操作是種阻礙?？紤]到最近測序成本從2009年108.065 USD每基因組降低到2014年4.920 USD[這些數(shù)字包含人力、行政、管理、設(shè)施、試劑和耗材（http://www.genome.gov/sequencingcosts/）]和速度提升，適當深度cfDNA的全基因組測序最終將用于臨床目的。此外，更新的測序技術(shù)比如納米孔測序開始出現(xiàn)，可在不需要擴增的條件下增加準確度和可靠性，從而通過排除主要偏移來源提高靈敏度。
液體切片的臨床應用
迄今為止，臨床試驗執(zhí)行ctDNA分析的大型可控研究很少。一項包含105名實體瘤患者的研究證明了，在重復腫瘤活檢并不安全可行且檔案腫瘤基因組分析不充分時液體切片對晚期癌癥患者有益；研究中的患者被推薦參與I期分子靶向藥物試驗，用Sequenom MassArray System 和 OncoCarta組合分析體細胞突變。Schwarzenbach等人執(zhí)行了一項多中心研究，招募了388名沒有進行化療的原發(fā)乳腺癌患者并調(diào)查了8個基因的LOH。另一項研究包含108名轉(zhuǎn)移性CRC患者，監(jiān)測基準以及每個三線治療周期（西妥昔單抗和伊立替康）之前血漿中突變KRAS/BRAF等位基因的豐度。cfDNA和 KRAS濃度從基準到第3周期降低，在疾病進展時增加，突變丟失與療效受益有關(guān)，而治療期間出現(xiàn)突變可能是因為原發(fā)野生型疾病獲得性耐藥。同一小組研究了二線化療期間CRC患者的總cfDNA和健康對照以及具有不同并存病的患者的cfDNA。cfDNA濃度在CRC患者中比在對照中明顯更高，同樣使用伊立替康的情況下高濃度患者的存活期比低濃度患者短。另外，標志物分析與血漿KRAS突變相結(jié)合進一步增加了預后影響。
大家清楚認識到液體切片在臨床癌癥研究領(lǐng)域的應用，現(xiàn)在有些臨床試驗的設(shè)計通常包括液體切片。但是，關(guān)于液體切片在臨床實踐中的實際實施，有必要建立標準化的分析前和分析方法，包括血液采集、處理和儲存以及DNA提取、定量和大型前瞻性臨床研究的確認。只有在可控研究的過程中物流采樣（logistical sampling）才得以促進，從而提供統(tǒng)計學上強有力的樣品量包括治療前和隨訪樣品。只有在用充分樣品量執(zhí)行長期研究而且研究結(jié)果與無疾病存活率/總存活率和其他臨床背景相關(guān)時，才能取得臨床應用的進展。此外，因為ctDNA的釋放動力學沒有被完全闡明，所以與治療相關(guān)的ctDNA分析時機很重要，應該在不同時間點從相同患者獲得多份樣品。例如，服藥后不久和服藥期間監(jiān)測ctDNA可能獲得不同的ctDNA等位基因分數(shù)，提供有價值的ctDNA釋放動力學信息。
未來展望
許多數(shù)據(jù)表明ctDNA分析對于癌癥患者的診斷、預后和管理是一種補充工具；因此，ctDNA可用作非侵入性的癌癥生物標志物。雖然一般來說生物標志物發(fā)現(xiàn)是一個不斷發(fā)展的領(lǐng)域，但是很多腫瘤疾病缺乏周期性遺傳變化，突出了對發(fā)現(xiàn)特異性癌癥特征和提高基因組分析的分析和診斷靈敏度的需求。此外，需要更多地關(guān)注腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的復雜性。尚不清楚ctDNA是否代表不同部位的所有相關(guān)轉(zhuǎn)移性細胞克隆，是否代表促進臨床進展和/或治療抗性的不同亞克隆DNA。所以，需要進一步臨床評估、血漿DNA的比較序列分析、以及活檢與影像學研究和詳細功能研究相結(jié)合，來詳細評估臨床進展和/或治療抗性。近期研究表明我們顯然不能假設(shè)腫瘤內(nèi)異質(zhì)性只基于遺傳變化；所以，表觀遺傳變化也必須考慮，從而增加了另一個水平的復雜性。一般來說，表觀遺傳變化被認為是癌癥形成的早期事件，因此可能是早期檢測的適合標志物。不僅如此，非侵入性地確定表觀遺傳靶標成為癌癥化療以及化學預防的有效、有價值方法。
總之，雖然為了開發(fā)適當工具全面分析血漿DNA腫瘤基因組做出了所有努力，目前大多數(shù)實驗室過程在診斷環(huán)境下實際實施太費時費錢。但是，測序成本將進一步下降，而且該領(lǐng)域的技術(shù)也在不斷進步。因此，隨著技術(shù)進步和成本下降，實驗室（檢驗）醫(yī)學常規(guī)使用高分辨率的基因組方法只是時間問題。而且，循環(huán)中突變片段的豐度的極大變異性會影響方法學的分析靈敏度。在腫瘤特異性DNA數(shù)量對于當前可用技術(shù)而言太低的情況下，例如早期階段或最小殘留疾病，這尤其是決定性因素。取決于放大靈敏度的所有當前可用NGS方法，由于DNA聚合酶誤差率（一般是0.01%）受到限制。但是，第三代測序方法的出現(xiàn)將使PCR擴增和移相帶來的偏移相關(guān)問題最小化。
不考慮技術(shù)局限，需要進一步發(fā)展來建立臨床標準，在精心設(shè)計和充分權(quán)威的多中心研究中確認液體切片作為臨床生物標志物的效用。
（摘自Clinical Chemistry，版權(quán)歸其所有，僅供內(nèi)部學習）
編譯：王小茜
