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正常細胞中代謝活動產(chǎn)生的能量消耗主要依賴于線粒體氧化磷酸化（OxPhos），而在腫瘤細胞中則多表現(xiàn)為瘋狂地攝取葡萄糖進行有氧糖酵解。德國科學家Otto Warburg在1920年最先描述了這種在腫瘤細胞中產(chǎn)生能量的途徑，因此，這種現(xiàn)象也被稱為Warburg effect。

腫瘤的發(fā)生可由癌基因或抑癌基因的突變引起，這些遺傳突變直接或間接調(diào)節(jié)代謝酶的表達及活性，影響腫瘤信號轉(zhuǎn)導途徑和細胞反應。同時，腫瘤細胞對營養(yǎng)素的需求異常增加，以維持其苛刻的合成代謝需求和能量產(chǎn)生率，也影響周圍正常組織。腫瘤細胞具有更高的代謝可塑性，能夠以重塑腫瘤微環(huán)境的方式更好地適應較低或不斷變化的營養(yǎng)狀況。

分析腫瘤細胞代謝和信號通路之間的相互作用，了解影響腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)機制可以揭示腫瘤治療的新途徑，為基于新陳代謝的抗腫瘤藥物尋找潛在的治療靶標。

接下來，我們將分享幾個細胞能量代謝分析技術(shù)在腫瘤代謝檢測中的應用。

文獻一：

MTR4是與核外泌體相關(guān)的RNA解旋酶，在RNA加工和監(jiān)視中起關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)MTR4在肝癌細胞中表達升高，并可做為預測肝癌患者預后不良的獨立診斷標記。MTR4通過調(diào)節(jié)糖酵解關(guān)鍵基因（如GLUT1和PKM2）mRNA的可變剪接來驅(qū)動癌癥的代謝。

RNA測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除MTR4可導致肝癌細胞中糖酵解途徑的失調(diào)及幾種關(guān)鍵糖酵解基因的表達降低，提示MTR4可能在肝癌細胞糖酵解代謝中發(fā)揮作用。進一步通過細胞能量代謝分析技術(shù)SeahorseXF檢測細胞的胞外酸化率（ECAR）和細胞的耗氧率（OCR），與對照相比，MTR4的敲除可導致肝癌細胞的糖酵解降低及細胞的線粒體呼吸增強，氧化磷酸化水平升高，表明MTR4驅(qū)動了胞內(nèi)代謝從氧化磷酸化向糖酵解的轉(zhuǎn)變（圖1）。

圖1、肝癌細胞的糖酵解需要MTR4。

為深入了解MTR4驅(qū)動的糖酵解和腫瘤發(fā)生的潛在機制，研究人員在MTR4敲除的肝癌細胞中異位表達其下游關(guān)鍵糖酵解基因GLUT1，檢測細胞的ECAR，發(fā)現(xiàn)GLUT1的過表達可挽救由于MTR4敲除導致的糖酵解水平降低（圖2）。以上結(jié)果表明 MTR4在癌癥胞內(nèi)的氧化磷酸化和糖酵解的代謝轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用。

圖2、在MTR4沉默后，GLUT1的異位表達可以挽救肝癌細胞的糖酵解水平降低。

文獻二：

BACH1為氧化應激反應的關(guān)鍵因子，可直接與抗氧化劑基因啟動子中的ARE結(jié)合，并充當細胞內(nèi)血紅素水平的分子傳感器。長期補充抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸和維生素E會通過降低游離血紅素水平和穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子BACH1促進KRAS驅(qū)動的肺癌轉(zhuǎn)移。

本研究中，使用細胞能量代謝分析技術(shù)Seahorse XF對細胞的OCR和ECAR進行分析，研究人員發(fā)現(xiàn)與對照組（mTC）相比較，抗氧化劑處理的細胞（mTN）中的糖酵解率升高50％，OCR/ECAR比相應降低。為確定BACH1是否在功能上參與了糖酵解的增加過程，對其進行過表達后發(fā)現(xiàn)，肺癌細胞中的糖酵解隨之增加，相反，BACH1缺陷的mTN細胞的糖酵解率則有所降低（圖3）。

圖3、抗氧化劑以BACH1依賴的方式刺激糖酵解。

為進一步確定癌細胞的侵襲能力和糖酵解水平是否相關(guān)，過表達BACH1的下游糖酵解關(guān)鍵基因HK2，可增加mTC細胞的糖酵解和遷移能力，而過表達人葡萄糖-6-磷酸酶的催化亞基則可降低糖酵解速率和mTN細胞的遷移。敲低HK2可反轉(zhuǎn)BACH1誘導的糖酵解和細胞遷移能力。高糖酵解速率可以提高ATP的產(chǎn)生速率和總ATP含量，從而促進細胞運動。mTN細胞糖酵解產(chǎn)生ATP的速率和總ATP產(chǎn)生的速率，都高于對照組細胞（圖4）。表明抗氧化劑以BACH1依賴的方式刺激糖酵解，并促進癌細胞侵襲。

圖4、HK2刺激的糖酵解驅(qū)動抗氧化和BACH1依賴的遷移。

文獻三：

細胞因子誘導的含SH2的蛋白（CIS；由基因CISH編碼）是自然殺傷（NK）細胞中白介素15（IL-15）信號傳導的關(guān)鍵負調(diào)控因子。使用誘導的多能干細胞衍生的NK細胞（iPSC-NK細胞）敲除人CISH基因后，CISH^-/- iPSC-NK細胞表現(xiàn)出改善的代謝適應性，敲除人類iPSC來源的NK細胞CISH能夠發(fā)生代謝重編程，從而促進體內(nèi)持久性并增強抗腫瘤活性。

本研究中使用細胞能量代謝分析技術(shù)Seahorse XF檢測NK細胞的糖酵解和OxPhos的速率。低濃度IL-15中培養(yǎng)3天或7天后，CISH^-/-iPSC-NK細胞的糖酵解速率比對照細胞WT iPSC-NK和PB-NK細胞都有所增加；培養(yǎng)7天后，CISH^-/-iPSC-NK細胞中的OxPhos也明顯增加（圖5）。

圖5、人iPSC-NK細胞中CISH的缺失改善了代謝適應性。

雷帕霉素復合物1（mTORC1）在哺乳動物合成代謝和營養(yǎng)吸收中發(fā)揮重要作用。使用mTORC1抑制劑-雷帕霉素（rapa）處理CISH ^-/-iPSC-NK和WT iPSC NK細胞，導致CISH^-/-iPSC-NK細胞糖酵解減少和線粒體呼吸減少。rapa完全中和了CISH^-/-iPSC-NK細胞中改善的糖酵解和OxPhos，使代謝率達到了與WT iPSC-NK細胞相似的水平。結(jié)合其它功能實驗，說明CISH^-/-iPSC-NK細胞代謝適應性的改善是由mTOR途徑介導（圖6）。

圖6、CISH^-/-iPSC-NK細胞代謝適應性的改善由mTOR信號通路介導。

文獻四：

腫瘤微環(huán)境中癌細胞和浸潤的免疫細胞爭奪有限的營養(yǎng)物質(zhì)。本研究探討了腫瘤微環(huán)境中細胞亞群對葡萄糖和谷氨酰胺的獲取和攝取。

使用細胞能量代謝分析技術(shù)Seahorse XF檢測腫瘤微環(huán)境中CD45^-癌細胞、CD3⁺T細胞、CD11B⁺髓樣細胞和F4/80⁺巨噬細胞的ECAR和OCR。與腫瘤浸潤的T細胞和CD45^-癌細胞相比，分離的F4/80⁺巨嗜細胞維持較高的基礎(chǔ)胞外酸化率和基礎(chǔ)線粒體耗氧率。結(jié)合FDG親和力實驗結(jié)果，腫瘤微環(huán)境中的巨嗜細胞消耗的葡萄糖最多，并保持強大的葡萄糖代謝（圖7）。

圖7、腫瘤微環(huán)境中的髓樣細胞比癌細胞消耗更多的葡萄糖

接著檢測了rapa處理的上述腫瘤微環(huán)境中細胞亞群的代謝活性。發(fā)現(xiàn)雷帕霉素處理使離體的髓樣細胞的基礎(chǔ)細胞胞外酸化率和基礎(chǔ)線粒體耗氧率下降，而癌細胞和T細胞則保持不變，結(jié)合其他細胞和分子實驗結(jié)果，表明mTORC1參與了腫瘤微環(huán)境中細胞的葡萄糖攝取和代謝（圖8）。

圖8、mTORC1支持腫瘤微環(huán)境中細胞的葡萄糖攝取和代謝。

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