謝雨禮博士參加同寫意論壇活動(dòng)現(xiàn)場
回顧今年的行業(yè)熱點(diǎn)，小分子藥物的熱度在免疫療法的喧囂過后似乎有所回升，其中最大的亮點(diǎn)就是安進(jìn)公司的KRAS G12C小分子抑制劑AMG 510。繼ASCO后，9月中旬安進(jìn)在巴塞羅那的WCLC大會(huì)上更新了AMG 510的一期臨床數(shù)據(jù)：攜帶KRAS G12C突變的非小細(xì)胞肺癌病人中，960mg高劑量組ORR達(dá)到54%，疾病控制率100%，未見明顯毒副反應(yīng)?？紤]到這些病人都是經(jīng)過重度治療的，這個(gè)數(shù)據(jù)算是比較靚麗的。其實(shí)業(yè)界感到興奮，可能并不是因?yàn)檫@個(gè)數(shù)據(jù)有多好，而是RAS這個(gè)被認(rèn)為不可成藥的致癌基因之王，經(jīng)過30年努力，其直接抑制劑第一次接近成功。
圖1：AMG 510與KRAS G12C復(fù)合物結(jié)構(gòu)
▲10月底，同寫意15周年大會(huì)上，本文作者謝雨禮博士將在分論壇四主持“靶點(diǎn)與新藥述評”的圓桌對話，其中一個(gè)討論話題是“AMG510：開啟KRAS不可成藥靶點(diǎn)之門？”。同時(shí)，北京加科思藥業(yè)董事長王印祥博士將在10月30日做報(bào)告：SHP2和KRAS通道，PD-1之后的下一波重磅炸彈。敬請關(guān)注！
RAS是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤基因（oncogene）
為什么RAS在腫瘤中這么重要？這可能還得從腫瘤生物學(xué)的起源說起。19世紀(jì)末，巴斯德等巨匠的研究讓現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在抗感染領(lǐng)域獲得巨大成功。1876年，一個(gè)俄羅斯人成功地將腫瘤組織從一只狗移植到另外一只狗。1908年，兩個(gè)丹麥科學(xué)家發(fā)現(xiàn)母雞白血病細(xì)胞中的提取物可以讓其它鳥類感染白血病。這些觀察和研究讓人們相信腫瘤也是病毒所致的傳染病。1910年，洛克菲勒研究所的Peyton Rous從一只來自紐約長島的母雞中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)腫瘤病毒Roussarcoma virus(RSV, 勞氏肉瘤病毒)。此后，一系列導(dǎo)致動(dòng)物腫瘤的RNA和DNA病毒相繼被發(fā)現(xiàn)。致病機(jī)理也得到了合理地解釋：這些病毒（RNA病毒通過逆轉(zhuǎn)錄酶）可以將腫瘤基因整合到被感染的宿主細(xì)胞中，誘導(dǎo)惡變并維持腫瘤細(xì)胞的無限分裂。發(fā)現(xiàn)RSV的Peyton Rous和發(fā)現(xiàn)RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的Howard Temin分別獲得1966年和1975年的諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。至此，人們深信腫瘤是一種病毒導(dǎo)致的疾病。直到1974年，UCSF的J. Michael Bishop和他的博士后Harold Varmus通過DNA探針意外發(fā)現(xiàn)未被感染的正常細(xì)胞中也存在此前RSV病毒中發(fā)現(xiàn)的腫瘤基因src。原來腫瘤基因早就存在于宿主的基因組當(dāng)中，遠(yuǎn)古時(shí)期，病毒從宿主細(xì)胞中獲得這些基因片段并加以改造，也就是說病毒所攜帶的腫瘤基因其實(shí)來自我們自身。這些發(fā)現(xiàn)打開了以基因變異為基礎(chǔ)的現(xiàn)代腫瘤生物學(xué)的大門。Bishop和Varmus也因此在1989年獲得了該領(lǐng)域的第三個(gè)諾貝爾獎(jiǎng)。Harvey和Kirsten等人在60年代分別發(fā)現(xiàn)了類似于RSV的逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的老鼠腫瘤基因HRAS和KRAS（1，2）。1982年，Weinberg等實(shí)驗(yàn)室在人類膀胱癌細(xì)胞T24/EJ中也發(fā)現(xiàn)了HRAS，使得RAS成為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤基因（3）。50多年過去后，RAS基因被發(fā)現(xiàn)是腫瘤中最常見的突變基因之一，30%的腫瘤攜帶RAS變異，如果算上RAS調(diào)控因子和信號通路上下游的變異，幾乎覆蓋所有腫瘤，RAS變異每年造成一百萬以上的病人死亡，無愧是腫瘤基因之王。這也令人非常好奇，RAS到底具有什么神奇功能，令腫瘤細(xì)胞如此依賴？RAS與腫瘤抑制基因pRb和p53一起成為腫瘤領(lǐng)域難以攻克的高地
談到RAS的致癌功能，又要提起腫瘤發(fā)生機(jī)制的主要假說SMT（Somatic Mutation Theory）。該理論認(rèn)為腫瘤來源于正常細(xì)胞，基因突變的驅(qū)動(dòng)下，獲得生存優(yōu)勢，不斷進(jìn)行適者生存的進(jìn)化，最后演變成具有基因組不穩(wěn)定、無限增殖和抗凋亡等十大標(biāo)志的腫瘤細(xì)胞。這十大標(biāo)志或者說能力都服務(wù)于腫瘤細(xì)胞的唯一目標(biāo)：無限復(fù)制而獲得永生。細(xì)胞的復(fù)制開始于休止期（G0），接收生長因子信號的刺激后，啟動(dòng)分為四個(gè)階段（G1、S、G2和M）的細(xì)胞分裂周期。在這個(gè)周期中，母細(xì)胞一分為二，復(fù)制基因并均等地分配給兩個(gè)子細(xì)胞。
腫瘤基因突變或者異?？梢则?qū)動(dòng)生長因子信號失控，造成細(xì)胞不受控制的生長和分裂。如圖2所示，RAS處于各種信號通路的中樞位置，下游控制的通路包括Raf、PI3K和RalGDS等。RAS在分子水平上可以調(diào)控蛋白質(zhì)的合成、基因轉(zhuǎn)錄等過程；細(xì)胞水平上影響細(xì)胞形狀、生長、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移等等。生長因子受體EGFR、FGFR，以及轉(zhuǎn)錄因子Myc的變異也能驅(qū)動(dòng)腫瘤的形成，RAS既可以在這些腫瘤基因的下游傳遞放大信號，也可以反饋增強(qiáng)它們的致癌功能。
圖2：RAS的調(diào)控及信號通路（Cancer Cell 2014,25,272）
如果腫瘤基因突變就輕易導(dǎo)致腫瘤，物種進(jìn)化就不會(huì)保留它們。事實(shí)上，腫瘤的發(fā)生還需要對抗腫瘤抑制基因的作用。正常細(xì)胞的生長、分裂和增殖是由復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)所嚴(yán)格控制的。比如細(xì)胞周期中，遺傳物質(zhì)復(fù)制出錯(cuò)就可能被中止分裂。細(xì)胞周期中有一個(gè)重要節(jié)點(diǎn)叫做限制點(diǎn)（R point），處于G1期的中后段，細(xì)胞分裂一旦越過R點(diǎn)，就無法停止，即使沒有生長因子的存在，細(xì)胞分裂也會(huì)進(jìn)行到底。控制這個(gè)R點(diǎn)的關(guān)鍵基因叫做pRb。在CDK/Cyclin的調(diào)控下，磷酸化的pRb通過控制轉(zhuǎn)錄因子E2F決定細(xì)胞周期是否可以越過R點(diǎn)。pRb是限制細(xì)胞不正常分裂的最重要的檢查點(diǎn)，自然也是至關(guān)重要的腫瘤抑制基因。與RAS一樣，幾乎所有腫瘤中，pRb的正常功能一定程度被干擾。另一個(gè)與pRb同等重要的腫瘤抑制基因是監(jiān)控細(xì)胞健康狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子p53。正常細(xì)胞一旦受到破壞，p53會(huì)中止細(xì)胞的生長和分裂，啟動(dòng)修復(fù)機(jī)器，如果無法修復(fù)則啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。生長因子失控或者是pRb功能缺失，也會(huì)導(dǎo)致p53介導(dǎo)的凋亡。大量突變和功能異常的腫瘤細(xì)胞如果希望永生，必須擺脫p53的控制，因此p53的loss-of-funtion突變出現(xiàn)在三分之一的腫瘤之中，加上其相關(guān)通路的異常也是幾乎覆蓋100%的腫瘤。這樣，RAS過度激活以及pRb和p53功能喪失成為導(dǎo)致腫瘤的三座大山，它們是目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤中突變最多的三個(gè)基因。這也說明它們處于腫瘤細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)的最關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)上。廣義上說，絕大多數(shù)靶向藥物的靶點(diǎn)都處于這三個(gè)基因調(diào)節(jié)的信號通路中，比如EGFR、Braf、MEK、ERK、PI3K、Akt、mTor、CDK4/6、Parp、TGF-beta、Bcl-2和Mdm2等等。俗話說擒賊先擒王，十分遺憾目前還沒有直接靶向這三個(gè)靶點(diǎn)的藥物出現(xiàn)。從生物學(xué)的角度上看，pRb和p53是腫瘤抑制基因，功能異常經(jīng)常體現(xiàn)在蛋白缺失或者功能被抑制，難以用藥物進(jìn)行干預(yù)。近年來，也有人嘗試用小分子糾正變異p53的構(gòu)象，恢復(fù)其野生型的功能。相關(guān)藥物APR-246和COTI-2已進(jìn)入臨床研究，但進(jìn)展緩慢，有效性仍未得到驗(yàn)證。乍一看，RAS相對于pRb和p53，作為異常激活的腫瘤基因，是更加理想的藥物靶點(diǎn)。事與愿違，經(jīng)過多年的探索，RAS被認(rèn)為是不可成藥靶點(diǎn)，攻克RAS成為制藥界的哥德巴赫猜想。RAS蛋白的結(jié)構(gòu)、工作原理和調(diào)控機(jī)制
為什么RAS長期以來被認(rèn)為不可成藥？這要從其結(jié)構(gòu)，工作原理和調(diào)控機(jī)制說起。RAS主要有三個(gè)亞型HRAS、KRAS和NRAS，其中KRAS通過RNA剪接又表達(dá)兩個(gè)不同的蛋白KRAS4A和KRAS4B。RAS蛋白是一種21kDa大小，位于細(xì)胞膜上的，擁有GTPase酶活性的鳥嘌呤核苷結(jié)合蛋白。如圖2所示，RAS是GDP/GTP循環(huán)控制的二進(jìn)制分子開關(guān)：GDP結(jié)合時(shí)處于“關(guān)”的狀態(tài)，而GTP結(jié)合則代表“開”的狀態(tài)。沒有刺激信號時(shí)，這種關(guān)開狀態(tài)的轉(zhuǎn)換非常緩慢。接收到信號后，鳥苷酸交換因子GEFs被招募到細(xì)胞膜上與RAS結(jié)合并釋放GDP。由于細(xì)胞中GTP的濃度遠(yuǎn)高于GDP，RAS蛋白迅速結(jié)合GTP，招募其下游信號通路的效應(yīng)蛋白進(jìn)入“開“的狀態(tài)。在GAPs（GTPase activating protein）的作用下，RAS的GTPase的活性被提高上千倍，其結(jié)合的GTP被水解成GDP，RAS重新進(jìn)入GDP結(jié)合的“關(guān)”的狀態(tài)，從而完成一個(gè)完整的循環(huán)。
RAS分子開關(guān)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)也得到了很好地闡釋。RAS蛋白1-166個(gè)氨基酸組成G-domain，這個(gè)結(jié)構(gòu)域在各亞型中高度保守，余下的23-24個(gè)氨基酸組成高度可變區(qū)（HVR）。D-domain帶有RAS的核苷酸結(jié)合口袋，包括P-loop（殘基10-17），Switch I（殘基30-38）和Switch II（殘基60-67）等區(qū)域。從其名字可以判斷，Switch I 和 II是RAS功能切換的關(guān)鍵。如圖3所示，GTP結(jié)合的活性狀態(tài)時(shí)，GTP分子中Gamma位磷酸分別與Switch I的T35和Switch II的G60形成氫鍵，像彈簧一樣將它們拉在一起。一旦GTP被水解，Gamma位磷酸被水解掉，Switch I和II被分開，回到GDP結(jié)合的非活性構(gòu)象。圖3：RAS蛋白GDP/GTP循環(huán)（Cell 170, June29, 2017）
從上述描述可以看出GTP水解是淬滅RAS活性的關(guān)鍵步驟。不難想象，如果基因突變抑制了GTP水解，RAS蛋白將被鎖在激活狀態(tài)。正因?yàn)槿绱?，RAS最常見的突變就發(fā)生在G12、G13和Q61三個(gè)位置。前面提到RAS高效水解GTP需要GAP蛋白參與，GAP與RAS結(jié)合后，將一個(gè)精氨酸(arginine)殘基伸到催化位點(diǎn)，協(xié)助水解，這個(gè)殘基被稱作精氨酸手指（arginine finger）。
結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究表明，除了脯氨酸，G12或G13替換成任何氨基酸，立體位阻將阻礙精氨酸手指進(jìn)入催化位點(diǎn)。Q61則是直接參與水解過程，協(xié)助定位一個(gè)水分子，穩(wěn)定水解反應(yīng)的過渡態(tài)。其它突變還有與GDP結(jié)合相關(guān)的氨基酸如A146。比較有意思的是，雖然各個(gè)亞型的D-domain和功能高度類似，但腫瘤中發(fā)現(xiàn)的RAS突變主要集中在KRAS(85%)，NRAS(12%)次之，HRAS(3%)最少（圖4）。
最近的研究也許提供了部分解釋，他們發(fā)現(xiàn)KRAS4B而不是其它亞型通過HVR區(qū)域與calmodulin結(jié)合，從而抑制非經(jīng)典Wnt通路，有利于保持腫瘤細(xì)胞的干性狀態(tài)（4）。
圖4：KRAS基因突變（Semin Cancer Biol. 2019Jun 27）
言歸正傳，為什么RAS難以成藥呢？首先，RAS各個(gè)亞型的D-domain高度類似，直接靶向RAS很難達(dá)到高度選擇性；第二，小分子藥物最常見的是抑制酶的活性，但RAS比較特殊，GTP水解酶與其功能反相關(guān)，需要開發(fā)酶的激活劑；第三，藥物分子無法與底物競爭，因?yàn)镽AS與GTP的親和力常數(shù)達(dá)到皮摩爾（picomolar）級別，而細(xì)胞中GTP的濃度高達(dá)0.5mM；第四，除了不可逾越的核苷酸口袋，RAS蛋白其它地方缺乏有利于小分子結(jié)合的口袋；第五，RAS的調(diào)控和功能執(zhí)行都是通過蛋白-蛋白的相互作用實(shí)現(xiàn)的，很難通過小分子干預(yù)。這些蛋白相互作用發(fā)生在細(xì)胞膜內(nèi)，單抗等大分子難以觸及。
因?yàn)檫@些原因，制藥界早期將注意力轉(zhuǎn)移到RAS的高度可變區(qū)（HVR）。HVR是RAS用來定位細(xì)胞膜的區(qū)域，末端包含CAAX系列。RAS蛋白合成后，要進(jìn)行一系列修飾才能進(jìn)入細(xì)胞膜。CAAX系列的Cys被異戊烯化（prenylation）后，AAX被轉(zhuǎn)化酶RCE1切除，最后Cys的羧基被甲基轉(zhuǎn)移酶ICMT所甲基化。
細(xì)胞膜定位對于RAS的功能至關(guān)重要，其調(diào)節(jié)蛋白如GEFs、GAPs以及各種效應(yīng)蛋白都依賴細(xì)胞膜移位（translocation）進(jìn)行調(diào)控。讓人沒想到的是，抑制RCE1和ICMT有時(shí)反而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，原因還不太清楚。其實(shí)抑制RAS通路的某個(gè)環(huán)節(jié)造成反向激活(paradoxical activation)還比較常見，比如Raf和MEK抑制劑中都發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，這也是RAS藥物開發(fā)的一個(gè)難點(diǎn)。
開發(fā)RAS異戊烯化抑制劑的探索就要曲折得多。早在1989年，美國西南醫(yī)學(xué)中心的科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)法尼基轉(zhuǎn)移酶（FT）介導(dǎo)的異戊烯化是RAS活性所必須的(5)。FT抑制劑對RAS變異腫瘤有效且安全性可接受?；谶@些研究，F(xiàn)T抑制劑被推上了臨床，但臨床結(jié)果不理想，對于占大多數(shù)的KRAS和NRAS病人無效?；仡^分析，這里有一個(gè)“坑“當(dāng)時(shí)被忽視了。
前面提到，HRAS是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的RAS腫瘤基因，F(xiàn)T抑制劑早期工作都是基于HRAS突變展開的。不幸的是，RAS亞型的異戊烯化有所差異。FT被抑制后，KRAS和NRAS能夠通過GGTase 1異戊烯化所彌補(bǔ)，而HRAS卻不能（6）。這樣，F(xiàn)T和GGTase1抑制劑聯(lián)用才能有效抑制KRAS和NRAS突變的腫瘤，但也容易產(chǎn)生不可耐受的毒副反應(yīng)。
目前，F(xiàn)T抑制劑用于HRAS突變的病人仍在進(jìn)行臨床研究。9月份，Kura公布了FT抑制劑tipifarnib的一個(gè)臨床結(jié)果：在13名攜帶HRAS突變的難治或是復(fù)發(fā)的膀胱癌病人中，ORR達(dá)到38%。異戊烯結(jié)合蛋白PDEδ是RAS細(xì)胞內(nèi)外膜之間穿梭運(yùn)輸?shù)闹匾閭H蛋白。
2013年德國馬克斯-普朗克研究所的科學(xué)家報(bào)道了第一個(gè)KRAS-PDEδ蛋白相互作用的小分子抑制劑Deltrasin（7），隨后又報(bào)道了毒性更小的Deltazinone（8），這些化合物可以有效抑制KRAS驅(qū)動(dòng)的胰腺癌。這一靶點(diǎn)迅速成為RAS藥物研究的熱點(diǎn)，但還未有臨床研究數(shù)據(jù)報(bào)道。
干預(yù)RAS細(xì)胞膜定位的藥物開發(fā)至少目前來看還不算成功。近年來，隨著共價(jià)、變構(gòu)、蛋白蛋白相互作用、PROTAC等小分子新技術(shù)的發(fā)展，RAS直接抑制劑又回到了人們的視野。1997年Schering-Plough報(bào)道了第一個(gè)直接抑制RAS的小分子化合物（9）。
此后大量RAS抑制劑被相繼報(bào)道，包括合成小分子、天然產(chǎn)物和多肽模擬分子，這些分子主要靶向RAS核苷酸交換，RAS-SOS和RAS-Raf相互作用等（10）。還有Sulindac和Rigosertib等老藥或臨床化合物也發(fā)現(xiàn)直接作用于RAS。這些早期工作中，最受關(guān)注的是RAS-SOS抑制劑。SOS是最常見的GEF，如前所述，抑制GEF干擾GTP的結(jié)合。
基因泰克2012年報(bào)道了通過NMR技術(shù)和Fragment-based技術(shù)發(fā)現(xiàn)的RAS-SOS小分子抑制劑DCAI，但這些化合物活性不高(11)，而且隨后的研究發(fā)現(xiàn)RAS-SOS抑制劑也存在負(fù)反饋激活的問題(12)。2019年，Bayer報(bào)道了一類通過雙向篩選獲得的KRAS G12C-SOS1抑制劑，穩(wěn)定KRAS-SOS1復(fù)合物同時(shí)抑制SOS1活性，活性達(dá)到納摩爾級別，且可以與G12C抑制劑聯(lián)用(13)。
早期報(bào)道的RAS抑制劑由于各種原因都沒有繼續(xù)開發(fā)，這也是RAS得到“不可成藥“這個(gè)名聲的主要原因。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)興起后，藥物開發(fā)更加強(qiáng)調(diào)靶向腫瘤細(xì)胞特有的變異。RAS具有重要的生理功能，KRAS生殖突變的老鼠不能成活。RAS調(diào)節(jié)因子變異造成一組統(tǒng)稱為RASopathy的罕見病，僅NF1（GAP蛋白）變異，全球就超過10萬病人。因此，避開正常細(xì)胞，特異性靶向腫瘤細(xì)胞RAS變異可能帶來較少的副作用。然而，前面提到RAS變異主要是G12、G13和Q61三個(gè)位點(diǎn)，可逆競爭性的小分子藥物要區(qū)分野生型和變異蛋白的結(jié)合口袋非常困難，更別提RAS蛋白上就沒有什么適合小分子結(jié)合的口袋。EGFR和BTK等基于色氨酸（Cys）共價(jià)結(jié)合的不可逆抑制劑的成功，讓KRAS G12C脫穎而出成為RAS變異的理想靶點(diǎn)。首先，G12C是第三大常見的RAS變異，特別是在非小細(xì)胞肺癌和腸癌中排在第一位，每年新發(fā)G12C腫瘤病人接近3萬人；其次，變異產(chǎn)生的Cys可以成為不可逆抑制劑進(jìn)攻的目標(biāo)，減少對結(jié)合口袋的依賴；第三，Cys不可逆抑制劑已經(jīng)證明可以獲得相對較高的特異性；最后，G12C位于SWI、SWII以及P-loop三方交界的區(qū)域，抑制G12C可能對RAS構(gòu)象和活性產(chǎn)生重要影響。2013年UCSF的Shokat實(shí)驗(yàn)室在《Nature》上報(bào)道了通過“Tethering”技術(shù)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)G12C抑制劑(14)。“Tethering”技術(shù)由同在UCSF的WellsJames教授開發(fā)，基本原理就是針對含有Cys的靶點(diǎn)，利用雙硫鍵的小分子碎片庫進(jìn)行篩選(15)。雙硫鍵與Cys的SH發(fā)生交換后，小分子碎片就會(huì)通過Cys連接在蛋白上。這些懸掛在蛋白上的Cys很容易被隨后的還原處理所清除，而那些在Cys附近找到結(jié)合口袋躲避的碎片就會(huì)生存下來。篩選了480個(gè)雙硫化合物后，Shokat等人找到了兩個(gè)Hits，其中一個(gè)就是圖5所示的6H05。隨后開發(fā)這個(gè)項(xiàng)目的Wellspring公司進(jìn)行了一系列優(yōu)化，得到更為有效的先導(dǎo)化合物ARS-853。詳細(xì)研究發(fā)現(xiàn)，這類化合物只能作用于GDP結(jié)合的RAS，化合物與G12C共價(jià)連接在Switch II下面誘導(dǎo)了一個(gè)此前不存在的變構(gòu)口袋S-IIP。這造成了兩個(gè)后果：1）RAS與GDP的親和力增加，不易轉(zhuǎn)向GTP構(gòu)象；2）抑制了GEF催化的核苷酸交換。簡單地說就是將RAS鎖在了非活性狀態(tài)。新的G12C抑制劑在體內(nèi)外腫瘤模型上都展現(xiàn)了很好的劑量關(guān)系和可預(yù)測的在靶活性。圖5：第一個(gè)KRAS G12C抑制劑的發(fā)現(xiàn)（根據(jù)文獻(xiàn)14插圖編輯）
對于制藥公司來說，原創(chuàng)研究到此就基本夠了。但細(xì)細(xì)思考，還是有些讓人不解的地方。第一個(gè)就是，腫瘤細(xì)胞中變異的RAS主要以GTP結(jié)合的激活狀態(tài)存在，而這些G12C抑制劑只能靶向GDP結(jié)合的KRAS；第二個(gè)疑問是，共價(jià)抑制劑首先要與靶點(diǎn)有較強(qiáng)的結(jié)合，才能特異地與目標(biāo)位置的Cys快速反應(yīng)；而G12C抑制劑與S-IIP口袋結(jié)合比較弱而且是事后誘導(dǎo)的。
對于第一個(gè)問題，紐約MSKCC的Neal Rosen教授2016年在《Science》上發(fā)表文章，提出了一個(gè)“Trapping“的作用機(jī)制（16）。他們認(rèn)為KRASG12C類似于野生型，也存在GTP/GDP循環(huán)，因?yàn)镚12C內(nèi)在的GTPase活性并沒有下降。因此，RAS突變不是原來認(rèn)為的一直處于完全鎖死的激活狀態(tài)，而是一種在接收刺激信號后”hyperactive”的狀態(tài)。
這樣，G12C抑制劑不斷將RAS蛋白trap在GDP狀態(tài)而消耗GTP結(jié)合的RAS。這實(shí)際上是一個(gè)平衡反應(yīng)，因此這類抑制劑需要較長的作用時(shí)間。這個(gè)發(fā)現(xiàn)對G12C抑制劑的臨床應(yīng)用是有重要指導(dǎo)意義的。因?yàn)樗幬锏淖饔檬抢瓌?dòng)一個(gè)平衡反應(yīng)，也許需要較大的劑量，對于藥物的安全性要求比較高。另外，RAS突變?nèi)杂蠫TP/GDP循環(huán)，也就是仍然受到各種信號的調(diào)控，這樣為G12C抑制劑與其它藥物如EGFR抑制劑的聯(lián)用提供了可能。
對于第二個(gè)問題，2018年，Wellspring Biosciences的科學(xué)家發(fā)表了一項(xiàng)詳細(xì)研究（17）。文章認(rèn)為G12C抑制劑與傳統(tǒng)的共價(jià)抑制劑不同，他們與Cys的結(jié)合不是親合力驅(qū)動(dòng)的，而是由化合物與Cys的高反應(yīng)性驅(qū)動(dòng)的。
令人費(fèi)解的是，這些化合物以及G12C中的Cys，內(nèi)在的反應(yīng)性都很低，這也是為什么這類化合物的特異性非常好的原因。那問題是，這個(gè)特異的高反應(yīng)性從哪里來的？晶體結(jié)構(gòu)顯示，是因?yàn)镚12C附近的賴氨酸Lys16質(zhì)子化后，可以穩(wěn)定Cys共價(jià)反應(yīng)的過渡態(tài)，起到自催化的作用（圖6）。
另外，由于GTP的gamma位磷酸可以干預(yù)Lys16的作用，可能是G12C抑制劑只能作用于GDP結(jié)合的RAS的原因之一。比較有意思的是，基于GDP結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的，以結(jié)合力驅(qū)動(dòng)的G12C共價(jià)抑制劑比如SML-8-73-1系列反而沒有取得理想的效果（18）。
這個(gè)案例顯示，一個(gè)非常淺、動(dòng)態(tài)的臨時(shí)誘導(dǎo)的結(jié)合口袋，雖然無法為小分子提供足夠的親和力，也能通過“高反應(yīng)性”驅(qū)動(dòng)的共價(jià)抑制劑有效抑制，這為小分子共價(jià)抑制劑在其它所謂“不可成藥”靶點(diǎn)的應(yīng)用提供了無限的遐想。
圖6：G12C抑制劑與Cys共價(jià)反應(yīng)的自催化機(jī)理（文獻(xiàn)17）
RAS抑制劑巨大的商業(yè)前景、G12C扎實(shí)的基礎(chǔ)研究和有說服力的前期數(shù)據(jù)，在制藥界激發(fā)了一股開發(fā)G12C抑制劑的熱潮，幾乎每個(gè)月都有新的專利公開。進(jìn)展最快的就是已經(jīng)公開一期臨床數(shù)據(jù)的安進(jìn)，Wellspring和Mirati等公司的產(chǎn)品也已進(jìn)入臨床。其它大公司比如Pfizer、AZ都在跟進(jìn)，國內(nèi)的fast-follow也是爭先恐后。由于篇幅有限，me-too開發(fā)和結(jié)構(gòu)改造方面的進(jìn)展就不在這里贅述。
G12C抑制劑開發(fā)的潛在風(fēng)險(xiǎn)
KRAS G12C抑制劑的初步成功，無疑是令人興奮的。讓人們重新認(rèn)識(shí)了RAS生物學(xué)，發(fā)現(xiàn)RAS突變不是持續(xù)激活，而是“hyperactive”。化學(xué)上展示了小分子共價(jià)抑制劑既可以通過親和力驅(qū)動(dòng)，也可以是反應(yīng)性驅(qū)動(dòng)，為這類藥物的應(yīng)用拓展了空間。但RAS還有太多的未解之謎和挑戰(zhàn)，AMG 510的成功只是攻克RAS難題的一小步。即使是G12C抑制劑，還有許多未知的東西，給其開發(fā)前景帶來不確定性。1）前面已經(jīng)提到，由于化合物作用于平衡反應(yīng)，可能需要較大劑量，AMG 510就是在高劑量組效果比較好，這對藥物的安全性要求比較高；2）另外，腫瘤進(jìn)展的各個(gè)階段的DNA分析發(fā)現(xiàn)，KRAS變異在肺腺癌和胰腺癌腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性較小，而在肺鱗癌和腸癌中KRAS變異出現(xiàn)較晚，含有KRAS突變的腫瘤細(xì)胞可能只是其中的一個(gè)“亞克隆”（19，20）。這預(yù)示RAS變異對藥物的敏感度可能與腫瘤類型高度有關(guān)。AMG 510目前來看在腸癌中的臨床效果比較差，似乎驗(yàn)證了這些基礎(chǔ)研究的結(jié)果；3）分子靶向藥物出現(xiàn)耐藥被認(rèn)為是難以避免的。AMG 510作為KRAS直接抑制劑，剛開始臨床研究，是不是容易耐藥還難以判斷。不過，安進(jìn)公開的臨床數(shù)據(jù)顯示，在15周時(shí)間內(nèi)11名PR病人已有2名發(fā)生疾病進(jìn)展，其中1人死亡（圖7）。這也許是為什么AMG510一期數(shù)據(jù)公開后，安進(jìn)的股票沒漲反而是下跌。基礎(chǔ)研究給出的信號也不太好。比如，體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對KRAS變異的依賴程度與細(xì)胞的生長條件高度相關(guān)，3D培養(yǎng)的細(xì)胞對G12C抑制劑的敏感程度大于2D培養(yǎng)。這讓人擔(dān)心腫瘤微環(huán)境的調(diào)整即可輕松擺脫對KRAS的依賴。2014年一篇《Cell》文章的研究顯示，胰腺癌細(xì)胞通過激活Yap1，可以克服對KRAS依賴（21）；4）還有就是RAS是否存在二聚或者多聚的情況在學(xué)術(shù)界還有較大爭議，但這也可算作機(jī)制不明確的風(fēng)險(xiǎn)。RAS通路的RAF蛋白就是通過二聚產(chǎn)生抑制劑誘導(dǎo)的反向激活。圖7：AMG 510的I期臨床數(shù)據(jù)
1）首先，考慮靶向其它RAS突變，比如最常見的G12D和G12V。因?yàn)檫@類蛋白缺乏合適的Cys或者其它非天生的可共價(jià)結(jié)合的氨基酸，要取得足夠的活性和選擇性比較困難。BI今年8月份報(bào)道了一個(gè)納摩爾活性的結(jié)合在Switch區(qū)域的非共價(jià)抑制劑BI-2852（22）。機(jī)制上不同于G12C抑制劑，這個(gè)化合物可以同時(shí)抑制活性和非活性狀態(tài)RAS，且不限于G12C。令人遺憾的是，細(xì)胞測試上活性不高，而且出現(xiàn)了類似于BRAF抑制劑的反向激活的老問題；2）另外，藥物聯(lián)用是克服耐藥和提高療效的一個(gè)常用辦法。臨床前研究表明，KRAS變異對腫瘤免疫療法比較敏感，特別是P53共變異的病人。AMG510與PD-1單抗聯(lián)用的臨床研究即將展開，讓我們拭目以待。KRAS抑制劑與RAS通路上其它藥物的聯(lián)用也值得探索，比如EGFR、BRAF、MEK、PI3K，以及SHP2抑制劑，等等；3）尋找與RAS變異合成致死的藥物，最近的例子有XPO1抑制劑和鐵死亡誘導(dǎo)劑等；4）隨著新技術(shù)的發(fā)展，人們也將眼光轉(zhuǎn)向了其它非小分子藥物形式，比如siRNA（23）、細(xì)胞內(nèi)單抗碎片（24）等。用于RAS蛋白降解的PROTAC也有不少專利公開。這些研究都是很好的嘗試，但離真正的臨床應(yīng)用還有很長的路。比較有意思的是，細(xì)胞治療的權(quán)威Rosenberg教授最近在《NEJM》上報(bào)道了一例針對KRAS G12D的TIL療法。經(jīng)過G12D特異和HLA-C*8:02等位基因限制的T細(xì)胞治療，一個(gè)50歲的帶有肺轉(zhuǎn)移的女性腸癌患者取得了9個(gè)月的PR。然而，HLA-C*8:02的廣泛性如何還有爭議，有專家認(rèn)為非常罕見。
在新藥難覓的今天，RAS直接抑制劑的突破，哪怕是一小步，也讓人無比欣慰。中國創(chuàng)新藥這兩年經(jīng)歷了比較大的起伏，向原創(chuàng)新藥轉(zhuǎn)型的呼聲日益高漲。KRAS G12C抑制劑的開發(fā)也許能給我們稍許啟示。基礎(chǔ)研究確實(shí)是原創(chuàng)新藥的基礎(chǔ)，但能否，多長時(shí)間能導(dǎo)致新藥的發(fā)現(xiàn)卻未可知。RAS從60年代發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷了50多年，其中對其生物學(xué)有貢獻(xiàn)的基礎(chǔ)研究數(shù)以千計(jì)，作為一個(gè)潛在的靶點(diǎn)是十分明了的事情，但直到2013年，Shokat實(shí)驗(yàn)室才找到了第一個(gè)具有成藥性的直接抑制劑。Shokat的大膽嘗試很重要，但我認(rèn)為突破的關(guān)鍵是其UCSF同事Wells James教授開發(fā)的“Tethering“技術(shù)。這個(gè)技術(shù)2000年發(fā)表后，一直默默無聞，看似沒有什么用處。這說明藥物創(chuàng)新的生態(tài)環(huán)境多么重要，不是單打獨(dú)斗可以實(shí)現(xiàn)的。從商業(yè)的角度上看，Shokat幫助建立的Wellspring公司應(yīng)該是原創(chuàng)，但是很快被fast-follow的安進(jìn)公司超越，大概率AMG 510將成為第一個(gè)上市的G12C抑制劑。所以，在中國新藥研發(fā)轉(zhuǎn)型的關(guān)鍵時(shí)期，各方應(yīng)該靜下心來做自己擅長的事情，無論是基礎(chǔ)研究、me-too還是原創(chuàng)，營造藥物創(chuàng)新良好的生態(tài)。真正的原創(chuàng)新藥可能沒有什么路徑，也沒有什么時(shí)間表，事情做好了，就水到渠成了。1. Nature 1964; 204:11041105. 92. Natl Cancer Inst. 1967; 39:311-3354. Cell 2015 Nov 19;163(5):1237-12515. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 Nov;86(21):8323-76. J Biol Chem 1997, 144597. Nature 2013 May 30;497(7451):638-428. Nat Commun. 2016 Apr 20;7:113609. Bioorg Med Chem. 1997 Jan;5(1):125-3310. Nature Review Drug Discovery 2016,15,77111. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Apr 3;109(14):5299-30412. Mol Cancer Ther 17:1051–1060.13. PNAS 2019 ,116 (7), 2551–256014. Nature 2013 Nov 28;503(7477):548-5115. Proc Natl Acad Sci USA 2000 Aug 15;97(17):9367-7216. Science 2016 February 5; 351(6273): 604–60817. Nat Struct Mol Biol. 2018 Jun;25(6):454-46218. Angew. Chem. Ent. Ed. 2014,53, 19919. N Engl J Med. 2017 Jun1;376(22):2109-2121 Intratumor heterogeneity subclonal20. Cell 1990 Jun 1;61(5):759-6721. Cell 2014 Jul 3;158(1):185-197.22. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Aug 6; 116(32): 15823–1582923. Cancer Dicovery 2014， 4，118224. Nat Commun. 2018 Aug 9; 9(1):3169.25. N Engl J Med. 2016 December 08; 375(23): 2255–2262
