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近年來(lái)結(jié)直腸癌患者逐漸呈現(xiàn)低齡化趨勢(shì)，生物鐘的紊亂被認(rèn)為是潛在誘因之一，其生物分子機(jī)制尚未明確。本研究通過(guò)基因干預(yù)和環(huán)境干預(yù)構(gòu)建生物鐘紊亂模型，發(fā)現(xiàn)生物鐘紊亂可促進(jìn)Apc驅(qū)動(dòng)的結(jié)直腸腫瘤進(jìn)展。作者使用經(jīng)過(guò)基因編輯的小鼠腸道類(lèi)器官模型，證實(shí)了干擾生物鐘可驅(qū)動(dòng)Apc雜合性突變，激活Wnt信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)c-Myc表達(dá)促進(jìn)糖酵解代謝。本研究闡明了生物鐘紊亂與結(jié)直腸癌之間存在先前未知的機(jī)制聯(lián)系，對(duì)預(yù)防癌癥的低齡化具有重要意義。

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科學(xué)問(wèn)題：結(jié)直腸癌的低齡化趨勢(shì)與年輕人作息不規(guī)律有關(guān)。目前普遍認(rèn)為生物鐘在腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，但其背后的驅(qū)動(dòng)機(jī)制尚不明確。

邏輯基礎(chǔ)：（1）生物鐘紊亂促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。（2）Apc突變會(huì)異常激活Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖，推動(dòng)腸腺瘤發(fā)展，臨床研究發(fā)現(xiàn)在80%的結(jié)直腸癌病例中存在Apc異常，因此Apc突變?cè)诮Y(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。（3）生物鐘相關(guān)分子（分子鐘）由核心轉(zhuǎn)錄因子、晝夜運(yùn)動(dòng)輸出周期分子(CLOCK)和芳烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白樣蛋白 1（Arntl，其編碼 BMAL1）組成，分子鐘可以控制細(xì)胞周期進(jìn)程并調(diào)節(jié)腸上皮中的 Wnt分泌，對(duì)維持腸道干細(xì)胞功能具有重要作用。

科學(xué)假設(shè)：生物鐘紊亂引起分子鐘改變并驅(qū)動(dòng)Apc雜合性突變，從而過(guò)度激活Wnt信號(hào)通路以促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展。

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1、Bmal1缺失與Apc突變可協(xié)同促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展

為了確定生物鐘紊亂促進(jìn)結(jié)直腸癌的分子機(jī)制，作者開(kāi)發(fā)了新的組織特異性基因工程小鼠模型，在Villin-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠中敲除Apc和Bmal1基因，構(gòu)建了Bmal1^?/?小鼠、Apc ^/Δex1–15小鼠和 Apc ^/?;Bmal1^?/?小鼠。在小鼠9至10個(gè)月齡時(shí)對(duì)其實(shí)施安樂(lè)死，作者在 Apc ^/-;Bmal1^-/-小鼠與Apc ^/- 小鼠的腸道中觀察到明顯的腸息肉，而野生型 (WT) 和Bmal1^-/-小鼠未發(fā)現(xiàn)腸息肉，這一現(xiàn)象說(shuō)明單獨(dú)的 Bmal1^-/-不足以引發(fā)小鼠腸息肉的形成。隨后，作者對(duì)小腸進(jìn)行H&E染色，結(jié)果提示W(wǎng)T和 Bmal1^-/-組織可以顯示正常的小腸結(jié)構(gòu)，Apc ^/-小鼠的腸道 H&E切片含有異常隱窩病灶及少許管狀腺瘤，而Apc ^/-;Bmal1^-/-小鼠的腫瘤變化最明顯，從異常隱窩病灶和管狀腺瘤延伸到浸潤(rùn)性腺癌。作者進(jìn)一步對(duì)息肉進(jìn)行計(jì)數(shù)和測(cè)量，在 Apc ^/-;Bmal1^-/與Apc ^/--小鼠中發(fā)現(xiàn)大量腸息肉。小鼠的生存分析結(jié)果顯示，與WT和Bmal1^-/-相比， Apc ^/-;Bmal1^-/-小鼠的生存率最差。最后，作者為了確定晝夜節(jié)律紊亂對(duì)CRC發(fā)病機(jī)制的影響，對(duì)WT 和Apc ^/-小鼠生活環(huán)境的光周期每隔一天進(jìn)行調(diào)整，以模擬每周三到四次夜班工作。結(jié)果提示，生物鐘紊亂增加了 Apc ^/-小鼠的腫瘤數(shù)量和大小。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明Bmal1和Apc變異可協(xié)同促進(jìn)體內(nèi)腸息肉病和結(jié)直腸癌進(jìn)展。

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2、Bmal1缺失促進(jìn)了腸道體外類(lèi)器官的增殖

為探究生物鐘影響上皮細(xì)胞生長(zhǎng)特性的分子機(jī)制，作者隨后構(gòu)建了腸類(lèi)器官模型。WT、Bmal1^-/-和Apc ^/-小鼠的小腸類(lèi)器官都形成了典型的具有出芽隱窩的腸樣結(jié)構(gòu)。從Apc ^/-;Bmal1^-/-小鼠分離的腸道類(lèi)器官最初生長(zhǎng)為腸樣，但在連續(xù)傳代中，類(lèi)器官形態(tài)逐漸轉(zhuǎn)化為腫瘤球體。EdU檢測(cè)顯示其增殖能力顯著增強(qiáng)，CellTiter-Glo檢測(cè)顯示其活力也顯著增加。此外，作者通過(guò)計(jì)算形成的成熟類(lèi)器官與接種單細(xì)胞數(shù)量間的比率來(lái)確定類(lèi)器官的生成效率。與所有其他基因型相比，Apc ^/-;Bmal1^-/-基因型類(lèi)器官形成效率顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明Bmal1缺失和Apc突變協(xié)同導(dǎo)致腸道類(lèi)器官的過(guò)度增殖干性狀態(tài)，進(jìn)而說(shuō)明其在加速生物轉(zhuǎn)化中起重要作用。

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3、Bmal1缺失可誘導(dǎo)腸道類(lèi)器官的整體轉(zhuǎn)錄組重構(gòu)和Wnt信號(hào)通路的失調(diào)

為了明確Bmal1在腸上皮腫瘤進(jìn)展中的作用，作者對(duì)傳代15代（晚期傳代）以上的不同基因型類(lèi)器官進(jìn)行了RNA測(cè)序。差異基因表達(dá)分析揭示了Apc ^/-;Bmal1^-/-類(lèi)器官相對(duì)于其他三種基因型轉(zhuǎn)錄層面的明顯差異。使用基因集富集分析，作者發(fā)現(xiàn)在Apc ^/-;Bmal1^-/-類(lèi)器官中與結(jié)直腸腫瘤發(fā)生相關(guān)的通路上調(diào)，包括缺氧誘導(dǎo)因子1和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、Wnt信號(hào)以及促炎通路信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)通路，并具有上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化特征。這些數(shù)據(jù)表明 Bmal1和Apc的同時(shí)丟失顯著改變了腸道腫瘤進(jìn)展相關(guān)基因的表達(dá)。

為了探究Bmal1缺失過(guò)度激活腸道 Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制，作者首先分析了早期Apc ^/-;Bmal1^-/-腸樣類(lèi)器官與晚期傳代類(lèi)器官中基因表達(dá)的變化，以確定Wnt信號(hào)傳導(dǎo)是否在培養(yǎng)中發(fā)生了漸進(jìn)性變化。值得注意的是，經(jīng)典的 Wnt 靶基因 Axin2 和Survivin僅在作為晚期傳代Apc ^/-;Bmal1^-/-腫瘤類(lèi)器官中顯著上調(diào)。為了確定激活的 Wnt 信號(hào)是否足以驅(qū)動(dòng)小鼠類(lèi)器官中腸狀體轉(zhuǎn)變?yōu)榍驙铙w，作者使用Wnt3a條件培養(yǎng)基處理WT類(lèi)器官。在培養(yǎng)3-5天內(nèi)，在WT類(lèi)器官中可見(jiàn)以Wnt3a劑量依賴(lài)性方式從腸樣到球狀形態(tài)的轉(zhuǎn)變。這些數(shù)據(jù)表明，Wnt 信號(hào)可能是類(lèi)器官形態(tài)轉(zhuǎn)變的原因。

Wnt3a 是經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的已知配體，作者分析了Wnt3a的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它在晚期傳代Apc ^/-;Bmal1^-/-類(lèi)器官中被下調(diào)。在熒光素酶報(bào)告基因分析中，也驗(yàn)證了晚期Apc ^/-;Bmal1^-/-類(lèi)器官條件培養(yǎng)基中Wnt3a配體活性顯著降低。因此，我們假設(shè)這些發(fā)生轉(zhuǎn)化的類(lèi)器官以不依賴(lài)Wnt配體的方式增殖。進(jìn)一步，作者通過(guò)對(duì)比含表皮生長(zhǎng)因子 (EGF)、Noggin和 R-spondin (ENR)的完整類(lèi)器官培養(yǎng)基和不含R-Spondin的EN培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)Apc ^/-;Bmal1^-/-在EN培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的類(lèi)器官具有與ENR相似的形成效率，而WT和單突變類(lèi)器官在缺乏Wnt樣配體時(shí)類(lèi)器官形成能力顯著降低。通過(guò)在培養(yǎng)基中加入Wnt信號(hào)傳導(dǎo)小分子抑制劑2 (IWP-2)，進(jìn)而觀察類(lèi)器官形成效率，作者發(fā)現(xiàn)Apc /^-;Bmal1^-/^- 類(lèi)器官仍能夠在所有測(cè)試劑量下有效地形成類(lèi)器官。這些數(shù)據(jù)表明 Apc /^-;Bmal1^-/^-類(lèi)器官以不依賴(lài)配體的方式過(guò)度激活Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。

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4、Bmal1缺失促進(jìn)Apc雜合性缺失

作者通過(guò)RNA-seq分析和qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在Apc ^/-;Bmal1^-/-晚期傳代類(lèi)器官中Apc表達(dá)意外丟失。作者認(rèn)為 Bmal1缺失可能導(dǎo)致Apc基因喪失表達(dá)來(lái)驅(qū)動(dòng)腫瘤的形成。作者開(kāi)發(fā)了一種dPCR檢測(cè)來(lái)確定Apc拷貝數(shù)變異 (CNV) 是否是基因表達(dá)喪失的根本原因。結(jié)果顯示W(wǎng)T和Bmal1^-/-類(lèi)器官的Apc拷貝數(shù)接近2，Apc ^/--類(lèi)器官的預(yù)期拷貝數(shù)接近1，而轉(zhuǎn)化后的Apc ^/-；Bmal1^-/-球體的Apc拷貝數(shù)為0。為了確定在從腸體到球體的形態(tài)轉(zhuǎn)換過(guò)程中Apc拷貝數(shù)是否丟失，作者從未轉(zhuǎn)化的早期傳代、中期傳代和完全轉(zhuǎn)化的晚期傳代Apc ^/-;Bmal1^-/-類(lèi)器官中分離出來(lái)基因組DNA進(jìn)行拷貝數(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)早期Apc ^/-;Bmal1^-/-類(lèi)器官的Apc拷貝數(shù)接近1，中期傳代中減少，在晚期Apc ^/-；Bmal1^-/-類(lèi)器官中達(dá)到0。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明Apc拷貝數(shù)的丟失發(fā)生在Apc ^/-;Bmal1^-/-類(lèi)器官?gòu)恼Ｄc細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤球體時(shí)。

為了定義Apc基因座內(nèi)的拷貝數(shù)丟失區(qū)域并識(shí)別額外的全基因組突變，作者使用從早期和晚期 Apc ^/-;Bmal1^-/-類(lèi)器官中分離的基因組DNA進(jìn)行全基因組測(cè)序，結(jié)果顯示Apc雜合性缺失發(fā)生在轉(zhuǎn)化的晚期Apc ^/-;Bmal1^-/-球體中，外顯子在Apc基因座的幾乎整個(gè)編碼區(qū)域中丟失。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明Bmal1可維持基因組和Apc拷貝數(shù)的穩(wěn)定，對(duì)過(guò)度激活Wnt信號(hào)傳導(dǎo)和加速腸道轉(zhuǎn)化具有重要作用。

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5、腸道生物鐘紊亂激活MYC癌基因

c-Myc是眾所周知的Wnt靶基因，在激活糖酵解以及維持快速增殖細(xì)胞的高代謝需求方面發(fā)揮重要作用。作者認(rèn)為腸道 Bmal1的丟失可驅(qū)動(dòng) Apc雜合性缺失并上調(diào)Wnt依賴(lài)性c-Myc表達(dá)和隨后的糖酵解代謝的激活。為了證實(shí)這個(gè)假設(shè)，作者進(jìn)行了基因表達(dá)分析和WB檢測(cè)，證實(shí)c-Myc基因表達(dá)和MYC蛋白豐度僅在晚期傳代轉(zhuǎn)化的Apc ^/-;Bmal1^-/-類(lèi)器官中顯著上調(diào)。作者進(jìn)一步分析了參與調(diào)節(jié)糖酵解和谷氨酰胺分解的MYC靶基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)己糖激酶2 (Hk2)、丙酮酸激酶 M2 (Pkm2)、谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (Slc7a5)以及谷氨酰胺酶2 (Gls2)的表達(dá)在晚期傳代的 Apc /^-;Bmal1^-/^- 類(lèi)器官中顯著增加。作者隨后對(duì)c-Myc進(jìn)行了敲低，有效地降低了兩個(gè)獨(dú)立的類(lèi)器官系中的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)豐度，并顯著抑制 MYC靶基因表達(dá)。MYC敲低也顯著抑制了Apc ^/-;Bmal1^-/-類(lèi)器官的形成。這些結(jié)果表明，MYC激活對(duì)于增強(qiáng)轉(zhuǎn)化的Apc ^/-;Bmal1^-/- 類(lèi)器官的干性和生長(zhǎng)至關(guān)重要。

為了證明 Bmal1丟失可導(dǎo)致糖酵解代謝激活，作者將穩(wěn)定同位素示蹤與質(zhì)譜分析相結(jié)合，對(duì)葡萄糖代謝產(chǎn)物進(jìn)行追蹤。結(jié)果顯示，糖酵解代謝物和乳酸在晚期Apc ^/-;Bmal1^-/-類(lèi)器官中被高度標(biāo)記。此外，糖酵解分支的生物合成途徑，如己糖胺和絲氨酸合成途徑，在Apc ^/-;Bmal1^-/-類(lèi)器官中被大量標(biāo)記。作者觀察到雙突變轉(zhuǎn)化的類(lèi)器官中標(biāo)記的嘌呤和嘧啶衍生物增加，尿素循環(huán)和尿酸的標(biāo)記中間體減少。這些數(shù)據(jù)表明，需要增加額外途徑的能量生成來(lái)支持Apc ^/-;Bmal1^-/-類(lèi)器官中細(xì)胞的加速生長(zhǎng)，并減少核苷酸合成所需的氮源分解代謝，以維持DNA復(fù)制和三磷酸腺苷 (ATP）生成。綜上，轉(zhuǎn)化的Apc ^/-;Bmal1^-/-類(lèi)器官表現(xiàn)出糖酵解代謝的增強(qiáng)和癌細(xì)胞生長(zhǎng)所需的分支通路的激活。

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6、患者腫瘤樣本表現(xiàn)出減弱的分子晝夜節(jié)律

為了探究生物鐘紊亂在人結(jié)直腸癌中的作用，作者探究了手術(shù)切除的人正常結(jié)腸與其配對(duì)結(jié)腸腫瘤組織的晝夜節(jié)律，并建立人源類(lèi)器官。隨后使用Bmal1驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染類(lèi)器官，并在3天內(nèi)實(shí)行實(shí)時(shí)生物發(fā)光測(cè)定。結(jié)果顯示，由正常結(jié)腸組織所構(gòu)建的人源類(lèi)器官顯示出強(qiáng)大的晝夜節(jié)律。相反，由相鄰結(jié)腸腫瘤構(gòu)建的人源類(lèi)器官晝夜節(jié)律幅度顯著降低。在七名獨(dú)立患者的配對(duì)類(lèi)器官中作者觀察到相似的結(jié)果。這些結(jié)果表明，正常的結(jié)腸組織維持著一個(gè)功能性的生物鐘，而在結(jié)直腸癌患者的腫瘤發(fā)生過(guò)程中，生物鐘被抑制或丟失。

為了確定生物鐘在更大的患者群體中是否起作用，作者從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中提取了512名CRC患者的腫瘤和周?chē)M織的RNA-seq數(shù)據(jù)和表型數(shù)據(jù)。初步分析顯示，12個(gè)核心生物鐘基因中的10個(gè)在腫瘤和正常周?chē)M織之間呈顯著差異表達(dá)。此外，雖然核心時(shí)鐘基因網(wǎng)絡(luò)的基因在周?chē)＝M織中呈顯著雙向相關(guān)，但這種相關(guān)性在同一患者的腫瘤樣本中被消除。因此，這些數(shù)據(jù)表明核心生物鐘的功能在人類(lèi)結(jié)直腸腫瘤中遭到破壞。為了測(cè)試Wnt信號(hào)傳導(dǎo)和晝夜節(jié)律基因這兩種途徑之間的相互作用是否與患者預(yù)后相關(guān)，作者根據(jù)核心生物鐘和Wnt通路中基因變異的主要成分，對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的個(gè)體分配了一個(gè)個(gè)性化的分?jǐn)?shù)，將Wnt 晝夜節(jié)律基因協(xié)方差高的個(gè)體與協(xié)方差低的個(gè)體分開(kāi)分類(lèi)。當(dāng)時(shí)鐘和Wnt不相關(guān)時(shí)，基因表達(dá)模式協(xié)方差低的人具有較差的OS。總的來(lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明功能時(shí)鐘在人類(lèi)結(jié)直腸腫瘤中遭到破壞，而人群水平的數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了核心時(shí)鐘和Wnt通路在結(jié)直腸癌進(jìn)展和患者生存中的相互作用。

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本研究結(jié)果表明，在存在Apc突變的情況下，腸道Bmal1的遺傳和外界環(huán)境因素促進(jìn)了結(jié)直腸癌進(jìn)展。本文通過(guò)離體腸道類(lèi)器官模型，證實(shí)了Apc ^/-;Bmal1^-/-類(lèi)器官通過(guò)促進(jìn)Apc雜合性缺失，過(guò)度激活 Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)并激活由c-Myc驅(qū)動(dòng)的增殖和代謝途徑從而發(fā)生腫瘤性轉(zhuǎn)化。

類(lèi)器官是高度復(fù)制體內(nèi)組織的體外生物模型，本研究巧妙利用基因編輯類(lèi)器官，觀察基因缺失或變異對(duì)類(lèi)器官造成的表型影響，并成功誘導(dǎo)類(lèi)器官自發(fā)成瘤，為未來(lái)生物學(xué)研究提供新的工具。本研究通過(guò)類(lèi)器官技術(shù)證實(shí)了生物鐘改變促進(jìn)Apc雜合性缺失并進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)腸上皮癌變進(jìn)程的分子機(jī)制。

基因編輯類(lèi)器官自發(fā)成瘤能否在P53、K-ras等腫瘤相關(guān)基因中得到進(jìn)一步驗(yàn)證？