感受態(tài)制備
1、農(nóng)桿菌選擇：LBA4404、EHA105、GV3101
2、農(nóng)桿菌活化：將保存的農(nóng)桿菌在固體LB培養(yǎng)基上畫線（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif或Str；EHA105：Rif或 Str；GV3103：慶大霉素。如果不加抗生素就有可能造成這些菌株的Ti質(zhì)粒丟失，導(dǎo)致農(nóng)桿菌缺乏侵染性），抗生素濃度為：50μg/ml。28℃培養(yǎng)。
3、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備：
1）挑取單菌落接種于3ml LB液體培養(yǎng)基中，220rpm 28℃振蕩培養(yǎng)至OD600 =0.5。
2）吸取1.5ml菌液于離心管中，冰浴10min；
3）5000（13000）rpm離心30s，棄去上清液；
4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl懸浮,冰浴20min；
5）5000（13000）rpm離心30s，棄去上清液；
6）每管用100μl 20mMCaCl2懸浮，用于轉(zhuǎn)化；
制備好的感受態(tài)細(xì)胞可馬上使用，也可按每管200ul分裝于無(wú)菌離心管中，于4℃保存48小時(shí)內(nèi)使用，長(zhǎng)期貯存時(shí)必須在液氮中速凍后轉(zhuǎn)一70℃保存。使用時(shí)從一70℃取出，置冰上融化后使用。
4、DNA直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌：
1）50μl農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中加入質(zhì)粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；
2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴鍋中水浴5min；
3）取出離心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振蕩培養(yǎng)3～5hr；
4）取出菌液于含相應(yīng)抗生素的LB平板上涂板，在培養(yǎng)箱中28℃條件下倒置培養(yǎng)。2天左右菌落可見。
（pEmu載體：AMP+Rif/Str；pK載體：Kan＋Rif/Str；pTCK載體：Kan＋Rif/Str）
本站僅提供存儲(chǔ)服務(wù)，所有內(nèi)容均由用戶發(fā)布，如發(fā)現(xiàn)有害或侵權(quán)內(nèi)容，請(qǐng)
點(diǎn)擊舉報(bào)。
