導(dǎo)語
結(jié)果解讀：
為了描述非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的免疫景觀，作者共收集了19名NSCLC患者（10例LUAD和9例LUSC）的腫瘤和相鄰正常肺組織（NL）樣本，共計40個樣本。這些樣本被切除后立即處理，生成富含活細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液，并直接使用分離的活細(xì)胞。隨后，進行了單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）以研究NSCLC兩個亞型之間的免疫異質(zhì)性（圖1a）。更多技術(shù)細(xì)節(jié)，包括質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和過濾步驟，請參見方法和材料部分。此外，與解離相關(guān)的基因FOS、FUN和HIF1A在甲醛固定石蠟包埋（FFPE）腫瘤樣本中均有表達。因此，它們在后續(xù)分析中被保留下來。CD45作為一種全白細(xì)胞標(biāo)記物，已被用于通過多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)定義白細(xì)胞。因此，在作者的研究中，所有獲得的細(xì)胞中，CD45+細(xì)胞被確定為免疫細(xì)胞，并被選擇用于后續(xù)分析（圖1a）?？偣?，通過質(zhì)量控制的有72,475個免疫細(xì)胞，涵蓋了17,277個獨特基因，其中有38,169個細(xì)胞來自腫瘤組織，34,306個細(xì)胞來自相鄰正常組織，這些細(xì)胞都不是特定于患者或疾病的（圖1c）。
對誘導(dǎo)LUAD和LUSC之間免疫異質(zhì)性的關(guān)鍵因素進行研究，可以初步了解癌癥亞型對免疫治療的不同反應(yīng)。17首先，與鄰近組織相比，盡管一些免疫功能相關(guān)基因共存，但在兩種主要的癌癥亞型（HLA-D家族、NKG7、GNLY、，和免疫相關(guān)基因FCGR3A在LUAD中富集，而LUSC明顯表達預(yù)后相關(guān)基因，如IGHG3、IGHG4、IGHG1和IGKC。此外，一些基因表現(xiàn)出細(xì)胞類型特異性表達，因此，作者進一步比較了兩種亞型之間的重疊DEG，發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞、Gran和CD8細(xì)胞在LUAD和LUSC之間共享更常見的失調(diào)基因，而DC、Tregs、CD4細(xì)胞和Mφ的重疊基因較少。這些結(jié)果表明了癌癥不同亞型的免疫特征的共同性和差異性。
為了進一步揭示這些免疫細(xì)胞在其微環(huán)境中的作用，作者隨后調(diào)查了LUAD和LUSC之間各個細(xì)胞類型的免疫細(xì)胞組成和差異表達基因（DEGs）。治療前患者不同組織來源的B細(xì)胞和肥大細(xì)胞的組成在這兩種癌癥亞型之間存在顯著差異（P < 0.05，Kruskal-Wallis檢驗）（圖2a），它們也共享最少的重疊基因（圖）。所有免疫細(xì)胞類型都顯示出癌癥亞型特異的特征和功能（圖2b、c），一些免疫球蛋白基因（IGKC、IGHG1、IGHG3、IGHG4和IGLC2）在LUSC組織的每個細(xì)胞類型中上調(diào)，與LUAD相比（圖2b），據(jù)報道這些基因在肺癌中從正常組織到腫瘤和轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞中逐漸增加。XIST在LUAD中上調(diào)，促進了肺癌細(xì)胞的生長。此外，作者注意到在LUSC中高表達的DEGs，如SPP1、CD8A和CD8B，主要在淋巴細(xì)胞和髓系細(xì)胞中表達，而在LUAD中高表達的DEGs主要富集在髓系細(xì)胞中，尤其是巨噬細(xì)胞，例如FN1、LTA4H、OLR1和FBP1（圖2b）。如圖2c和補充圖2d所示，除了B細(xì)胞外，淋巴細(xì)胞中特異表達的基因主要參與T細(xì)胞激活、細(xì)胞因子反應(yīng)和干細(xì)胞分化，而髓系細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和粒細(xì)胞，表達與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因通路和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致LUAD和LUSC之間免疫微環(huán)境的差異。
TME的特點是不同細(xì)胞群之間復(fù)雜的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，最終調(diào)節(jié)腫瘤生長并導(dǎo)致局部侵襲/慘淡轉(zhuǎn)移。為了探究癌癥亞型中假定的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用異質(zhì)性，作者部署了一組免疫相關(guān)配體-受體（L–R）對，以深入了解作者研究中確定的所有免疫細(xì)胞類型之間的調(diào)節(jié)關(guān)系。27預(yù)計共有2612對L–R對介導(dǎo)腫瘤組織中所有免疫細(xì)胞的相互作用。根據(jù)DEG分析，Mφ通過LUAD和LUSC中的大量相互作用分子對與其他細(xì)胞類型積極相互作用（圖3a）.在LUAD患者中，Mφ與DC、Gran、CD8細(xì)胞、B細(xì)胞和Tregs細(xì)胞類型的相互作用更為強烈，在LUSC患者中與DC、Gran、NK細(xì)胞的相互作用更強。Mφ也含有最多的配體和受體。
吸煙仍然是肺癌發(fā)生的最主要原因，LUSC與吸煙密切相關(guān)，而近年來非吸煙患者的LUAD診斷數(shù)量急劇增加，尤其是女性。因此，作者進一步研究了吸煙作為風(fēng)險因素對肺腺癌免疫微環(huán)境的影響，發(fā)現(xiàn)有吸煙史的患者具有更多的DC、Mφ和肥大細(xì)胞，而無吸煙史的患者則富集了更多的Gran、CD4和CD8細(xì)胞。在DEGs方面，癌基因XIST、HIF-2α靶基因SCGB3A1和腫瘤壞死因子（TNF）靶基因HSPA6在非吸煙組細(xì)胞中高表達，而DDX3Y、SCGB3A2和CCL18在有吸煙史的患者細(xì)胞中過度表達，尤其是在Mφ中。先前有報道稱CCL18會從乳腺癌相關(guān)Mφ釋放出來，促進血管生成和腫瘤進展，作者進一步加深了對這一因子在肺癌中的理解。
對吸煙組和非吸煙組之間的差異表達基因進行功能分析顯示，這些基因主要來自淋巴細(xì)胞，參與白細(xì)胞介素相關(guān)的信號通路。相反，來自髓系細(xì)胞的基因與T細(xì)胞激活、分化和細(xì)胞因子通路相關(guān)。GSEA還顯示，富集在Notch、細(xì)胞因子和Fc_epsilon_RI信號通路中的基因在吸煙組中豐富，而在非吸煙組中上調(diào)的基因可以激活EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）耐藥性、ErbB（對癌癥放療和化療耐藥性的貢獻）、PPAR、Wnt通路和ECM-受體相互作用（已知與非吸煙肺癌相關(guān)的通路）。
因此，作者推測免疫異質(zhì)性對非吸煙患者的腫瘤進展和藥物抗性產(chǎn)生了比吸煙患者更顯著的影響。巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞是這種差異的細(xì)胞基礎(chǔ)。
作者通過重新聚類15,853個CD4+ T細(xì)胞（圖4a、b）確定了七個不同的細(xì)胞亞型，包括：幼稚型（CCR7 + SELL + ）、效應(yīng)型（IFNG + CD44 + ）、調(diào)節(jié)型（IL2RA + FOXP3 + ）、耗竭型（PDCD1 + LAG3 + ）、記憶型（S100A4 + CD44 + ）、活化型（FOS + JUN + ）和γδT細(xì)胞（TRGC1 + TRDC + ）。具體而言，從腫瘤組織中獲得了9,603個（60.58%）CD4+ T細(xì)胞，其中24.21%來自LUAD組織，36.37%來自LUSC組織（補充圖5a）。CD4+ T細(xì)胞亞型的分布顯示，與相鄰組織相比，腫瘤組織中Tregs細(xì)胞富集，記憶細(xì)胞減少。此外，與LUSC相比，LUAD具有更多的效應(yīng)型和活化型細(xì)胞，以及較少的Tregs細(xì)胞（圖4b、c）。耗竭型、Tregs和效應(yīng)型細(xì)胞獲得了更多的差異表達基因（DEGs），揭示了它們在腫瘤免疫環(huán)境中的重要作用（補充圖5b）。
Mφ在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）發(fā)展中的重要作用已經(jīng)確立，但它們在LUAD和LUSC之間所承載的不同功能仍然大部分未知。一項先前的研究表明，Mφ可以進一步分為三個主要群體，即FABP4、SPP1和FCN1，并在特發(fā)性肺纖維化（IPF）的纖維化下葉中發(fā)揮多樣化的作用。為了廣泛研究兩種NSCLC亞型之間Mφ的異質(zhì)性，作者將11,016個Mφ基于特征基因重新聚類為四個離散的亞群，分別定義為FABP4、FCN1、SPP1和SELENOP-Mφ（圖5a-c）。然而，每個標(biāo)記物的表達并不完全局限于一個唯一的聚類，如小提琴圖所示（圖5c）。具體而言，作者觀察到LUAD組織中有1407個FCN1（19.5%）、2873個SPP1（39.9%）、2562個FABP4（35.6%）和364個SELENOP（5%）的Mφ，而LUSC樣本中則包含1381個FCN1（36.2%）、1698個SPP1（44.6%）、278個FABP4（7.3%）和453個SELENOP（11.9%）的Mφ。值得注意的是，F(xiàn)ABP4-Mφ主要存在于LUAD中，而SPP1-Mφ在LUSC中更為豐富（圖5b、d）。
為了識別巨噬細(xì)胞亞型特異基因表達的變化如何影響LUAD和LUSC之間的腫瘤免疫異質(zhì)性，作者應(yīng)用Monocle2重構(gòu)了所有獲取的巨噬細(xì)胞的偽時序軌跡推斷（圖6a、b）。Mφ軌跡產(chǎn)生了五個發(fā)育層次（狀態(tài)1-5），其中FABP4-Mφ亞型位于細(xì)胞進化地圖的起始點（圖6a、b），并且暗示了一個二叉分支結(jié)構(gòu)（圖6b）：FABP4-Mφ作為根，SPP1-Mφ作為分支1的終點狀態(tài)，以及SPP1-Mφ和FCN1-Mφ亞型作為分支2的終點狀態(tài)。值得注意的是，新的亞亞型SELENOP-Mφ在整個發(fā)育軌跡中存在，并主要積累在分支2的末端（圖6b）。LUAD和LUSC中Mφ的發(fā)育軌跡在起始狀態(tài)上顯示出明顯的差異，這表明FABP4-Mφ在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性（圖6b）。作者還確定了399個在分支1的偽時間中表達動態(tài)的差異表達基因，這是分支2中的一個子集。在分支2的終端狀態(tài)State 2中，來自NL(AD)組織的細(xì)胞比NL(SC)組織富集得更多，這表明分支2可能對兩種NSCLC亞型相鄰組織中微小差異的Mφ發(fā)育軌跡做出更大貢獻。
在確定Mφ亞群在非小細(xì)胞肺癌亞型中發(fā)揮不同功能，并且淋巴細(xì)胞也被認(rèn)為對LUAD和LUSC之間的異質(zhì)性有貢獻之后，作者進一步研究了每個Mφ亞群與淋巴細(xì)胞的相互作用。通過R軟件包CellChat（圖7a），在這兩種肺癌亞型中預(yù)測到了多個不同的細(xì)胞相互作用對。在LUAD中，F(xiàn)ABP4-Mφ與SELENOP-Mφ、SPP1-Mφ、CD4細(xì)胞、CD8細(xì)胞、Tregs和NK細(xì)胞之間的相互作用比LUSC中更強，而SELENOP-Mφ和FCN1-Mφ與LUSC中的CD4和CD8細(xì)胞之間的相互作用得到了增強。
總結(jié)
作者的研究以單細(xì)胞分辨率全面描述了NSCLC的免疫狀況，并確定了免疫微環(huán)境特征的亞型間差異。未來的研究需要在臨床和實驗上驗證作者在評估免疫細(xì)胞群及其對患者的預(yù)后價值方面的發(fā)現(xiàn)。
