越來(lái)越多的細(xì)胞與基因治療（CGT）產(chǎn)品問(wèn)世，用以治療各種疾病和恢復(fù)受損組織功能。細(xì)胞與基因治療產(chǎn)品屬于FDA生物制品評(píng)估和研究中心（CBER）監(jiān)管。開始臨床研究之前，企業(yè)需要提交并獲批準(zhǔn)新藥申請(qǐng)（IND）。開始上市銷售前，需要提交并獲批準(zhǔn)生物制劑許可證申請(qǐng)（BLA）。今天，借著美國(guó)FDA生物制劑評(píng)估和研究中心（CBER）Brian J Kwee和 Kyung E Sung 的一篇綜述文獻(xiàn)[1]，我們回顧一下細(xì)胞治療產(chǎn)品的制造策略現(xiàn)狀，挑戰(zhàn)和應(yīng)對(duì)。第一篇先闡述了常見(jiàn)的細(xì)胞療法，第二章來(lái)講講細(xì)胞產(chǎn)品的制造策略。臨床級(jí)細(xì)胞療法的開發(fā)（一）：基本概況
干細(xì)胞產(chǎn)品的先進(jìn)制造策略全球共有21種干細(xì)胞產(chǎn)品已在全球獲得批準(zhǔn)。值得注意的是，獲批產(chǎn)品主要是由造血干細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞組成。目前全球批準(zhǔn)的造血干細(xì)胞產(chǎn)品有10種，間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)品有10 種，還有一個(gè)角膜緣干細(xì)胞產(chǎn)品。▉ 造血干細(xì)胞
臍血來(lái)源的造血干細(xì)胞（HSC），引起移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)較低，但遺憾的是，數(shù)量較少，不便大規(guī)模使用。如果規(guī)?；R床，就需要進(jìn)行規(guī)?；瘮U(kuò)增臍血來(lái)源的造血干細(xì)胞。
一般，2D培養(yǎng)工藝的造血干細(xì)胞擴(kuò)增，通常會(huì)造成干細(xì)胞的丟失、擴(kuò)增有限和歸巢能力降低。原因可能是缺乏體內(nèi)造血干細(xì)胞生態(tài)位（HSC niche）的模擬微環(huán)境所致。
生物反應(yīng)器，可增強(qiáng)造血干細(xì)胞的擴(kuò)增。在生物支架中擴(kuò)增造血干細(xì)胞，可提供具有不同粘附和機(jī)械相關(guān)的3D微環(huán)境，可保持細(xì)胞“干性”，并促進(jìn)細(xì)胞增殖。與2D培養(yǎng)相比，3D培養(yǎng)更有利于維持造血干細(xì)胞群體的原始功能。在纖維蛋白多孔支架上，造血干細(xì)胞增殖程度最大。
▉ 間充質(zhì)干細(xì)胞
在免疫調(diào)控和組織修復(fù)的臨床試驗(yàn)中，需要大量的間充質(zhì)干細(xì)胞。因?yàn)閺慕M織里獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量較小，而臨床所需量大。國(guó)際共識(shí)是，間充質(zhì)干細(xì)胞的靜脈輸注劑量，人類通常為1~2 X10*6個(gè)細(xì)胞/kg。不同劑量可以影響治療效果，因?yàn)殚g充質(zhì)干細(xì)胞分泌的旁分泌因子取決于細(xì)胞數(shù)量。
目前，間充質(zhì)干細(xì)胞制備技術(shù)分為兩大類，包括平板制造工藝和生物反應(yīng)器制造工藝。利用自體來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行個(gè)體化治療，屬于小規(guī)模生產(chǎn)，各自企業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)和工藝也不盡相同。同種異體來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞規(guī)?；圃旃に囀抢蒙锓磻?yīng)器，模擬其在體內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育環(huán)境，進(jìn)行高效率增殖。同時(shí)，可以滿足自動(dòng)化、量產(chǎn)并能保證細(xì)胞的高活率和高質(zhì)量的要求，這也是今后各種干細(xì)胞規(guī)模化生產(chǎn)的發(fā)展趨勢(shì)。生物反應(yīng)器，已經(jīng)被用于間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增。微載體（有SoloHill?，CultiSpher?-S，Cytodex?-1，國(guó)內(nèi)自主研發(fā)品牌華龕生物3D TableTrix?），可使間充質(zhì)干細(xì)胞在攪拌過(guò)程中獲得更大的生長(zhǎng)。簡(jiǎn)單的說(shuō)，如果說(shuō)生物反應(yīng)器是一個(gè)海洋，那微載體就是一個(gè)個(gè)島嶼，而干細(xì)胞就是居住在這些島嶼上的居民。干細(xì)胞可以在微載體上的有效擴(kuò)增和分化，依賴其調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀和形成組織的能力。由于微載體具有多樣性，利用特定微載體的合理設(shè)計(jì)，可能為規(guī)模化細(xì)胞制備提供均一穩(wěn)定的制劑來(lái)源。攪拌懸浮式生物反應(yīng)器簡(jiǎn)圖（干細(xì)胞者說(shuō)制圖）
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免疫細(xì)胞產(chǎn)品的先進(jìn)制造策略全球共有12種免疫細(xì)胞產(chǎn)品獲得批準(zhǔn)上市。免疫細(xì)胞，目前只有T淋巴細(xì)胞和DC細(xì)胞產(chǎn)品被批準(zhǔn)上市。其中大多數(shù)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)品是用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的CAR-T細(xì)胞療法，而 DC細(xì)胞產(chǎn)品是用于治療實(shí)體腫瘤的疫苗。T淋巴細(xì)胞需要三種信號(hào)刺激擴(kuò)增，包括：T細(xì)胞受體；共刺激信號(hào)；促生存細(xì)胞因子。
關(guān)于T淋巴細(xì)胞擴(kuò)增，有兩種方法，一是用DC細(xì)胞刺激，二是用抗CD3/CD28免疫磁珠刺激。DC細(xì)胞刺激法比較常見(jiàn)，但成本太貴?？笴D3/CD28免疫磁珠刺激法，則不能提供生理相關(guān)的刺激因素。因此，采用先進(jìn)的細(xì)胞制造策略，則可能提供有效的方法來(lái)擴(kuò)增T淋巴細(xì)胞。比如通過(guò)下面幾種方法：（1）抗CD3/CD28涂層聚二甲基硅氧烷珠，比傳統(tǒng)免疫磁珠更誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增，可提供不同的機(jī)械因素；（2）抗CD3/CD28修飾的透明質(zhì)酸水凝膠，也促進(jìn)T淋巴細(xì)胞擴(kuò)增的作用，較軟的水凝膠比較硬更可有效地?cái)U(kuò)增小鼠CD8+T淋巴細(xì)胞。（3）抗CD3/CD28修飾的聚己內(nèi)酯支架，提供了獨(dú)特的微結(jié)構(gòu)，有效誘導(dǎo)原代人類T淋巴細(xì)胞不同種群擴(kuò)張的環(huán)境。（4）涂有IL-2的介孔二氧化硅微棒和抗CD3/CD28修飾的流體脂質(zhì)雙分子層，增強(qiáng)了原代T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增能力，比傳統(tǒng)的IL-2的免疫磁珠大2~10倍。（5）抗原肽修飾支架，比單核細(xì)胞衍生的DC細(xì)胞更大程度地誘導(dǎo)稀有T淋巴細(xì)胞的抗原特異性擴(kuò)增。減少支架上的抗CD3/CD28數(shù)量，既增加了T淋巴細(xì)胞的增殖，也降低了它們的耗竭標(biāo)記物。生物反應(yīng)器，可進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)和自動(dòng)擴(kuò)增。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，通過(guò)攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)攪拌速度越快，細(xì)胞擴(kuò)增效率越高。例如，CliniMACS Prodigy 便是全自動(dòng)生物反應(yīng)器的一種設(shè)備，可進(jìn)行CAR-T細(xì)胞的分離、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞擴(kuò)增等。Lonza公司的Cocoon，則是一種封閉式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，同樣可用于CAR-T細(xì)胞的分離、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增。在人體血液中，天然的NK細(xì)胞和DC細(xì)胞含量比較少，需要進(jìn)行體外擴(kuò)增才能滿足臨床治療用量。NK細(xì)胞，尚可進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增。DC細(xì)胞，則還不能進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增，目前只能依賴從外周血直接分離。在IL-4和GM-CSF存在的條件下，血液中的單核細(xì)胞可分化為未成熟DC細(xì)胞，隨后經(jīng)抗原和細(xì)胞因子（如TNF-a、PGE2和/或LPS）刺激，最終成為功能成熟的DC細(xì)胞。
生物反應(yīng)器，可用于DC細(xì)胞的擴(kuò)增。生物反應(yīng)器與細(xì)胞培養(yǎng)袋聯(lián)合使用，可通過(guò)單核細(xì)胞制備出功能成熟的DC細(xì)胞。使用細(xì)胞培養(yǎng)袋，可降低污染風(fēng)險(xiǎn)，易于DC細(xì)胞擴(kuò)增。一般來(lái)說(shuō)，制備的成熟DC細(xì)胞和天然DC細(xì)胞沒(méi)有顯著差異。生物反應(yīng)器，可用于提高NK細(xì)胞的擴(kuò)增效果。有證據(jù)表明，在組織培養(yǎng)瓶、氟聚合物細(xì)胞培養(yǎng)袋和波浪式生物反應(yīng)器三種體系中，經(jīng)生物反應(yīng)器培養(yǎng)的NK細(xì)胞，細(xì)胞純度和功能性細(xì)胞毒性更高。
與2D培養(yǎng)相比，3D培養(yǎng)的NK細(xì)胞可產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子、增殖效果更強(qiáng)，抗腫瘤功效更好。在多孔膠原海綿中，NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增也有類似的效果。
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文末小結(jié)
細(xì)胞療法是目前臨床前和臨床環(huán)境中研究最多的治療方式之一，許多細(xì)胞治療產(chǎn)品已獲得批準(zhǔn)。截止目前，全球經(jīng)批準(zhǔn)的細(xì)胞治療產(chǎn)品共33款，包括12種免疫細(xì)胞和21種干細(xì)胞（含10種造血干細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)品）。值得注意的是，許多已經(jīng)批準(zhǔn)的細(xì)胞療法正在開發(fā)新的適應(yīng)癥。
用于臨床級(jí)細(xì)胞擴(kuò)增的生物反應(yīng)器
用于臨床級(jí)細(xì)胞擴(kuò)增的生物反應(yīng)器案例
(a)在攪拌罐生物反應(yīng)器中，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)原代T淋巴細(xì)胞，可增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的增殖。
(b)在波狀生物反應(yīng)器中，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)NK細(xì)胞，可提高NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和純度。
(c)在帶有粘附的BMSC的中空纖維生物反應(yīng)器中，進(jìn)行HSC培養(yǎng)，可增HSC的擴(kuò)增效果。
(d)在攪拌罐生物反應(yīng)器中的微載體上，培養(yǎng)MSCs，可使細(xì)胞生長(zhǎng)更大。如何提高細(xì)胞的制備效率？如何長(zhǎng)時(shí)間維持細(xì)胞功能和特性？這是細(xì)胞臨床治療成功的關(guān)鍵。那么有沒(méi)有可模擬人體生理微環(huán)境的儀器設(shè)備呢，微生理系統(tǒng)可以做到！下一期我們講這一部分。
誰(shuí)持彩練當(dāng)空舞 ：干細(xì)胞基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展
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間充質(zhì)干細(xì)胞治療（一）：國(guó)際視野
間充質(zhì)干細(xì)胞治療（二）：先進(jìn)制造工藝
間充質(zhì)干細(xì)胞治療（三）：質(zhì)控體系
間充質(zhì)干細(xì)胞治療（四）：效力評(píng)價(jià)
臨床中的細(xì)胞治療（一）：基本概況
臨床中的細(xì)胞治療（二）：上市的細(xì)胞產(chǎn)品
臨床中的細(xì)胞治療（三）：活躍的臨床試驗(yàn)
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干細(xì)胞者說(shuō)
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