誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，IPS）與胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ES）的功能相似，是由終末分化的細胞經誘導重編程后得到的具有多能干性的細胞。其分化能力強，且與原細胞遺傳背景一致，在特定的條件下，IPS細胞能再分化成特定的細胞類型或組織。與原代提取的干細胞相比，IPS細胞具有無道德倫理爭議，來源廣泛，避免了免疫排斥反應的優(yōu)點。近年來，CRISPR基因編輯在IPS細胞中的應用越來越受到關注，并在疾病模型的建立與機制研究、細胞治療、藥物的發(fā)現與評價等方面有著巨大的潛在應用價值，為整個干細胞生物學領域和臨床再生醫(yī)學提供了新的研究思路。下面給大家介紹IPS的背景知識和聯(lián)合基因編輯后的應用。
IPS細胞的誘導
1●誘導原理
IPS細胞的誘導原理是將外源因子遞送至終末分化的細胞中，激活多能性基因的表達，使終末分化的細胞重編程成多能干細胞，即IPS細胞。這些外源因子通常有Oct4、Sox2、Klf4等。
2●誘導方法
通過逆轉錄病毒或慢病毒系統(tǒng)，使外源因子的基因序列整合至宿主細胞（如成纖維細胞）中，長期穩(wěn)定表達外源因子，可以啟動終末分化細胞的重編程。這種方法具有較高的誘導效率，但是得到的IPS細胞具有一定的致瘤性。因此為了避免這種風險，也有使用腺病毒或者質粒法等整合至基因組概率低的方法，或者將外源因子直接添加至培養(yǎng)基中使細胞吸收外源因子，但是這些方法也存在一個很大的問題：誘導效率極低。
為了提高誘導效率，一些研究者在誘導體系中添加一些小分子藥物或調整培養(yǎng)條件。例如，通過添加小分子藥物影響細胞基因組的甲基化程度或特定的信號通路等，從而提高重編程的效率。所以在誘導IPS細胞時，可適當添加小分子藥物，提高誘導效率。
另外，受體細胞的類型、狀態(tài)和傳代代數等因素對誘導成功率也有很大的影響。總體來講，分化程度高的細胞類型的誘導成功率較低。這可能與受體細胞的甲基化修飾和乙?；揎椀缺碛^遺傳修飾有關，使得誘導的條件也不盡相同。所以選擇合適的受體細胞進行誘導也很重要?，F今常用的受體細胞有原代成纖維細胞，這是由于取材方便和培養(yǎng)簡便。
IPS細胞的篩選與鑒定
受體細胞經誘導后，需要經過篩選與鑒定，來獲得目的IPS細胞。以相應物種的ES細胞作為對照，從分子和細胞水平進行檢測，判斷IPS細胞誘導的成功與否。
在分子水平可以檢測內源的干性標記基因的表達水平，如：Oct4、Sox2、Nanog等。雖然這些基因的表達水平在不同物種間存在差異，但一般情況下表達都較高。也可以通過免疫熒光染色的方法檢測這些標記基因，如果具有陽性信號，也表明具有多能干性。同時還能檢測內源干性標記啟動子的甲基化程度。此外還需檢測端粒酶的活性，來確定IPS細胞的永生化能力。
在細胞層面，能通過觀察細胞的形態(tài)進行判別：IPS細胞的形態(tài)與ES細胞相似，具有生長速度快、集群生長、核質比高、能長期傳代和AP染色呈陽性等特點。此外需要檢測分化能力和核型，這是由于外源基因整合具有隨機性，使誘導得到的 IPS 細胞會有較高比例的核型異常。
當IPS細胞遇到CRIPSR基因編輯
CRISPR基因編輯技術可有效且精準地對目的基因進行敲除、點突變和敲入。近年來，CRISPR和IPS細胞分別在基因研究和疾病治療等方面有著巨大的應用潛力。那么當CRISPR應用于IPS細胞時，就會摩擦出巨大的火花。
通過基因編輯的手段，糾正患者來源的IPS細胞的致病基因，并將糾正后的IPS細胞分化成特定的細胞、組織和器官，移植回患者體內用于治療，這是IPS細胞與基因編輯聯(lián)合應用最理想的做法。例如將皮膚或血細胞誘導成IPS細胞，再通過用CRISPR/Cas9技術將CISH基因敲除，獲得IPSC-CISH-/-細胞，再分化成IPSC-CISH-/--NK細胞（圖1）。研究結果表明，在白血病異種移植模型中，IPSC-CISH-/--NK細胞對腫瘤生長具有更強的抑制能力，并且IPSC-CISH-/--NK細胞在體內的持久性也顯著增加。
圖1. 在人類IPSC中構建CISH-/-IPSC-NK細胞[1]。
基因編輯過后的IPS細胞能被誘導成各種細胞、組織和器官，可以構建各種疾病模型，用于基因功能研究、疾病機制探索和藥物篩選等。比如Kung等在人類iPSC細胞中敲除了miR-26b（圖2），以探索miR-26b在發(fā)育和疾病中的作用。該miR-26b敲除的IPS細胞表現出正常的核型，表達多能性標記并分化為三個胚層的細胞。這為研究發(fā)育提供了一個良好的實驗模型，并闡明了IPSC衍生的人類類器官疾病模型中miR-26b下游調控異常的機制。
圖2.IPSC細胞中miR-26b的敲除與鑒定[2]。
基因編輯在IPS細胞中的應用難點
CRISPR和IPS細胞都有著巨大的應用前景，但是將兩者完美結合并不是一件容易的事情。要將兩者完美結合，受到多方面因素的影響。從前面介紹就可以知道，誘導IPS細胞就是一個復雜且坎坷的過程，存在誘導率低、培養(yǎng)條件苛刻等難點。那么將基因編輯應用于IPS細胞上也會有相似的問題，比如在編輯過程中，IPS細胞的培養(yǎng)條件比普通細胞系苛刻很多，稍不注意會容易使IPS細胞分化，丟失干性。并且在編輯過后，篩選單克隆較為困難，可能產生脫靶情況。
比如通過CRISPR/Cas9基因編輯技術，在誘導性多能干細胞IPS中敲除Human TNFAIP8L2基因。通過小片段的敲除方法，在TNFAIP8L2的2號外顯子設置兩條sgRNA，敲除2號外顯子300 bp（圖3）。經過PCR和測序鑒定，確定獲得TNFAIP8L2基因敲除的純合IPS細胞（圖4）。再通過免疫熒光染色，檢測NANOG、OCT4和SOX2三個干性標記基因，均能檢測出陽性信號（圖5），表明該敲除細胞具有干性。
圖3. hTNFAIP8L2的敲除策略。
圖4. IPS-hTNFAIP8L2-KO測序檢測。
圖5. IPS-hTNFAIP8L2-KO干性檢測。
參考文獻：
1. Zhu, Huang et al. “Metabolic Reprograming via Deletion of CISH in Human iPSC-Derived NK Cells Promotes In Vivo Persistence and Enhances Anti-tumor Activity.” Cell stem cell . 27,2 （2020）: 224-237.e6.
2. Kung, Louise H W et al. “Generation of a miR-26b stem-loop knockout human iPSC line, MCRIi019-A-1, using CRISPR/Cas9 editing.” Stem cell research. 50 102118. 10 Dec. 2020.
