Seahorse細(xì)胞能量代謝分析儀是檢測線粒體功能和細(xì)胞代謝的有力工具，在代謝研究中廣泛使用。因?yàn)槠錂z測過程中用到了一系列氧化磷酸化和電子傳遞抑制劑，也涉及到糖酵解、氧化磷酸化等不同代謝途徑，所以了解其基本原理和分析方法對理論學(xué)習(xí)和科研實(shí)踐都很有幫助。
Seahorse XFe96
Seahorse檢測時將細(xì)胞培養(yǎng)在專用的微孔板上，實(shí)時檢測加入不同藥物后的耗氧率（O2 consumption rate，OCR）和胞外酸化率（extracellular acidification rate，ECAR），來表征細(xì)胞的代謝狀況。其中OCR由線粒體電子傳遞造成，ECAR則源自乳酸發(fā)酵（糖酵解酸化）和線粒體產(chǎn)生的二氧化碳（線粒體酸化）。
OCR用來研究線粒體氧化磷酸化功能。檢測時一般先測定正常狀態(tài)下的基礎(chǔ)呼吸（basal respiration），然后加入寡霉素（oligomycin）抑制ATP合酶，這是OCR顯著下降，僅余下質(zhì)子滲漏（proton leak）造成的耗氧率。降低部分即為氧化磷酸化的耗氧率（ATP production）。
OCR曲線，引自agilent.com
加入解偶聯(lián)劑FCCP后，電子傳遞失去質(zhì)子梯度的約束，就會以最大速率進(jìn)行。所以O(shè)CR急劇升高，達(dá)到最大耗氧量（maximal respiration）。此值與基礎(chǔ)呼吸之差，稱為呼吸潛力（spare respiratory capacity）。最后加入電子傳遞抑制劑，如抗霉素A（antimycin A），完全抑制電子傳遞，耗氧率降至最低。
ECAR經(jīng)常用來研究糖酵解等代謝狀況。加入葡萄糖之前的基礎(chǔ)值是非酵解產(chǎn)酸，如線粒體呼吸產(chǎn)生的二氧化碳造成的線粒體酸化。之后加入葡萄糖，升高的值就代表糖酵解。
ECAR曲線，引自agilent.com
加入寡霉素后，因?yàn)檠趸姿峄灰种疲?xì)胞被迫完全采用乳酸發(fā)酵供能，所以產(chǎn)酸增加。此時的值稱為酵解容量（glycolytic capacity），與糖酵解之差稱為酵解儲備（glycolytic reserve）。最后加入的2-DG（2-脫氧葡萄糖），是己糖激酶的競爭性抑制劑，可以阻斷糖酵解，所以加入后曲線應(yīng)該回歸基礎(chǔ)值。
不過，直接用ECAR測定糖酵解會有一些偏差。因?yàn)榧尤肫咸烟呛?，不僅糖酵解增強(qiáng)，氧化磷酸化也會增強(qiáng)。這將導(dǎo)致線粒體酸化增加，使計算出的糖酵解量偏高。
糖酵解酸化和線粒體酸化，引自agilent.com
所以安捷倫公司開發(fā)了新的試劑盒，同時測定OCR和ECAR，通過耗氧量計算出二氧化碳產(chǎn)量?？鄢€粒體酸化后，得到的值稱為糖酵解質(zhì)子外排率（glycoPER），可以與細(xì)胞外乳酸積累速率呈 1:1 相關(guān)。所以glycoPER可以與其它測定結(jié)果相互比較。
glycoPER與細(xì)胞外乳酸積累速率呈 1:1 相關(guān)，引自agilent.com
