估計這是大家用得最多的，所以先講這個了。
免疫組化技術現(xiàn)在是很成熟的方法，但是對免疫組化照片的分析并沒有一個權威的說法?，F(xiàn)在可以查到無數(shù)篇應用圖像分析來分析免疫組化的文獻，但幾乎沒有哪一篇能詳細地敘述分析的過程與方法。
首先，免疫組化的樣品應該是用ＤＡＢ對免疫組化產物染色，同時用蘇木對細胞核進行復染。鏡下觀察樣品，細胞核被染上了藍色，胞漿間有黃色（強陽性的地方會呈現(xiàn)棕黃色）。居然經(jīng)常能看到其他顏色的免疫組化照片，這肯定是樣品制作過程中有了差錯。
用肉眼觀察免疫組化切片的結果只能是定性的，不準確的。使用圖像分析軟件定量地（至少是半定量）對照片測量出一個數(shù)值來自然比用肉眼看更準確。
切片上陽性反應物量是由圖片上黃色染色的深淺與面積一起表現(xiàn)的。所以最終要測量的就是圖片上黃色部分的累積光密度（IOD），這是個沒有單位的相對數(shù)值。就是把圖片上每個黃色的象素點的強度值全部累加起來得到的值。
IOD除以一個適當?shù)拿娣e，就是一個平均光密度。這個面積可以就是照片的面積，也可以是照片上一個組織區(qū)域的面積，或者是有黃色的區(qū)域的面積。必須根據(jù)切片的實際情況來適當選擇。
對于細胞核的免疫組化切片，在細胞核上，由于有藍色復染，所以需要另一種分析方法。將另作講解。
這張照片曝光稍大。但仍能表現(xiàn)出免疫組化的黃色染色與細胞核的藍染。
在拍攝照片時，需要注意的地方是：
１.所有的照片必須以同樣的顯微鏡環(huán)境與拍攝條件來拍攝。在拍攝照片時，要保持顯微鏡光源亮度的穩(wěn)定，用同樣的曝光時間拍攝照片。在更換視野或切片時，除了對焦距這個操作外，其他所有的操作都不能有變化。強陽性的樣品就是暗的黃的，弱陽性的樣品則亮一些，陰性樣品就是一片白。這樣才能測量出正確的密度值。
２.曝光的選擇：試拍攝一張空照片，看一下白色背景的亮度，應該在２３０附近。過低過高都不好。
3.注意相機白平衡：如果使用的是專業(yè)CCD相機，會有校正白平衡的功能，此時應對空視野進行白平衡校正。如果是普通的數(shù)碼相機，要關閉自動白平衡功能?；蛘哌x擇陽光模式。避免拍攝的照片因為色偏而偏藍或偏黃。
4.很多顯微鏡都是同時有熒光附件的，在拍攝熒光照片時要加上濾光片，注意有時候這些濾光片會忘了移開，結果拍攝的照片就會嚴重偏色。
正確地拍攝照片是圖像分析的基礎，以后的各項應用實例中往往都會先介紹如何拍攝照片。
圖像分析方法：
1.校正圖片光密度
分析免疫組化照片，第一步就是要校正光密度。照片上黃色點的亮度數(shù)值是灰度，黑色為0，白色為255.這與免疫組化強度是相反的。深色深的點，數(shù)值應該更大才對。在理論上，圖片上的灰度與樣品阻擋光線的物質光密度是一個指數(shù)關系，對于白色的色點，對應樣品透光率為100%，光密度為零。對于黑色的點，對應樣品透光率為0，光密度為無窮大，但實際上把這個光密度值定為2.0.校正光密度值就是把程序的光密度值設置成這樣的坐標。
在carliberation intensity的窗口里點new,然后選擇std option density.
把鼠標放在圖片上最白的地方，然后看程序窗口下方的狀態(tài)欄，會有顯示該點的三色各自的灰度值，在其顯示的數(shù)值中間選擇一個差不多的整數(shù)，比如230，或220，作為背景扣除值。操作方法是：點option按紐，在彈出的小窗口中的incident level中把默認的255改為230或220.返回就可以了。
最后在窗口右上方點一下system把這個校正作為系統(tǒng)光密度值應用于所有圖片。這個設定被默認地命名為intensity cal 0 。光密度校正的窗口不要關閉，可以移到邊上放著隨時檢查。有時候新照片未必會應用上，要重新調出剛才設定的intensity cal 0.
2.選色。
在segmentation中使用HSI模式，選擇H:0-30,S:0-255,I:0-230.然后點file -- save。HSI的選擇范圍是可以根據(jù)圖片情況作微調的。保存這個選色設置。一般放在圖片的保存文件夾里。默認的保存文件是rgb24.rge。
3.設置分析環(huán)境。
一個是select measurement。要選擇IOD。另外默認的選擇area都是要測量的。對area的過濾值，默認為10，實際上還可以大點，設置到25甚至50也行，可以把那些小的雜質點去掉。
另一個是option:
outline :filled
label style :none
dark background on sample :no
smoothing=1
filled hole:on
clean border : none
4.保存分析環(huán)境。
在count/size窗口中點file save settings。保存環(huán)境設置文件。
5測量
用irregular工具畫出測量區(qū)域。
這里很關鍵的一點就是如何畫這個測量區(qū)域。
最普通的情況下，要測量整張照片的光密度，就不必畫這個測量區(qū)域了。此時會測量照片上全部被選中的黃色的光密度總和（IOD SUM），面積就是照片的面積。
如果你拍攝的照片上，有個角正處于切片邊緣，沒有細胞，這就需要把這個角上的空白面積給扣掉了，此時畫的“測量區(qū)域”就應該沿著樣品的邊緣來畫。
另一種情況是，要測量一個癌巢里的蛋白表達，邊上正常組織上的表達不算。這時候就要沿著這個癌巢的邊界畫這個“測量區(qū)域”。
點count按紐。完事。測量數(shù)據(jù)在view statistics窗口中，讀取IOD SUM數(shù)值，作為這張照片的累積光密度值。其他的數(shù)值都是沒用的。
如果你用irregular工具畫了一個“測量區(qū)域”，那點count時，程序會只測量“測量區(qū)域”內的IOD。外面的不管。
在測量數(shù)據(jù)中顯示的area是黃色部分的面積。在很多情況下，這個面積值意義不大。
6.測量面積。
通常我們需要測量的是一個平均光密度（mean density）而不是積分光密度(IOD)。上一步已經(jīng)測量了IOD，現(xiàn)在就要測量area了，再說一遍，上一步的測量數(shù)據(jù)里的area在通常情況下并不是正確的area。
如果測量的是整張照片，area就是照片的面積。如果用irregular畫了“測量區(qū)域”，area就是這個測量區(qū)域的面積。此時只要在count/size窗口中點edit - convert AOI to object，然后就能在測量數(shù)據(jù)窗口中看到測量面積了。此時還能看到另一個IOD值，這個值是不能用的，它包括了藍色細胞核的光密度。
7.數(shù)值處理：
對每一張照片，要測量一個IOD SUM ，如果選擇了測量區(qū)域，還要測量一個area。
這張照片的測量值一般是平均光密度，它反映了這張照片上免疫反應物的表達強度。
mean density = (IOD SUM) / area
在測量整張照片的時候，可以只測量IOD SUM ，在這種情況下，所有照片的面積都是相等的。
mean density 與 IOD 都是個相對值，所以是沒有單位的。其實OD值本身就是個比例值。這個詞在分光光度計上常用，意思是optical density
通常我們有兩組實驗對象，實驗組與對照組，每組有十來個樣品，各拍攝幾張照片。
每個樣品拍攝的幾張照片測量的mean density再作一次平均，作為這個樣品的mean density.
一個實驗組的幾個樣品測量值可以計算其平均值與標準差，或者直接用T檢驗去統(tǒng)計兩組的統(tǒng)計學差異。
把一張照片的測量值當作一個數(shù)據(jù)也是可以的。
再次強調，一張照片只測量一個IOD值或mean density值，作為這張照片的測量數(shù)據(jù)。statistics窗口中的其他統(tǒng)計數(shù)值不必管它。
8.批量測量照片：
測量一組照片時，首先用一張比較典型的照片按上面步驟測量。然后在測量其他照片時，必須用這些測量條件來測量。因為已經(jīng)保存了背景校正、選色文件與測量環(huán)境文件，所以在測量時要直接調用這些設置文件。
8.1 把第一張照片最小化，不要關閉。
8.2 打開第二張照片，或者一次打開全部照片，激活一張。
8.3 檢查光密度校正窗口，確認應用了光密度校正。
8.4 在count/size中l(wèi)oad settings，調出環(huán)境設置文件。
8.5 點select color 調出segmentation窗口。確認處于Histograph及HSI模式下。再調出選色文件。
8.6 需要時用irregular畫測量區(qū)域。
8.7 點count 測量IOD，記錄數(shù)據(jù)（點statistics中的DDE to excel），再點 convert AOI to object 測量面積，再記錄數(shù)據(jù)（還是點statistics 里的DDE to Excel，注意，這是兩次向excel輸送數(shù)據(jù)，所以事先要在DDE option中選擇append data to end，否則后面的數(shù)據(jù)會沖掉前面的）。
8.8 關閉圖片，再測量下一張。
9.上面的測量步驟有個系統(tǒng)誤差。在測量IOD的時候是直接測量彩色照片的IOD，雖然對測量結果影響不大，如果希望測量得細致一點，就需要增加一個將彩色圖片轉換成黑白圖片的步驟。方法是：
在選擇完顏色后（就是上面的8.5之后），在segmentation窗口里的view下面選擇transparant on white.可以看見圖片上除了黃色外，其他地方都變成白色了。
然后點 create preview image復制這張效果圖片。
轉換這張圖片為8位灰度格式（grey scale 8）。
在這張灰度圖片上用irregular畫測量區(qū)域（就是按照上面的8.6以后繼續(xù)作）。
對灰度圖片還要再作一次選色，此時select color 按紐會變成 select ranges，只有一個 I 可以選擇，此時選擇范圍是0-240 。
這回的IOD測量值與稍大一點。這是正確的光密度測量值。但操作上增加了很多步驟。也不便于編制宏操作進行測量。
10.下面是一個關于免疫組化照片分析原理與方法的講座PPT。
還有一個屏幕錄像演示。
http://cid-9694254737a6cc5e.skydrive.live.com/browse.aspx/ipp%20flash
