打開圖片
這張照片中的黃色部分是免疫組化染色的陽性表達成分。處理目標(biāo)是通過測量圖片中黃色部分的"黃"度來反映相應(yīng)蛋白表達的的"量"。
對該圖片進行觀察，可以看到圖片中主要有三種主要顏色，一是染成藍色的細胞核，二是呈現(xiàn)出黃色的胞漿，三是細胞間的空隙區(qū)域，呈現(xiàn)出淺藍色，是為背景。
所 以首先要把圖片中呈現(xiàn)黃色的區(qū)域給挑選出來，然后才是測量這些挑出來的區(qū)域的各種測量參數(shù)，如面積、平均半徑、周長、光密度等等。這部分需要挑出來進行測 量的區(qū)域是我們最感興趣的地方，叫作AOI(area of interest)。AOI是IPP中最有用最重要的概念。如何能夠準(zhǔn)確地選取AOI就是使用IPP的關(guān)鍵操作。一旦準(zhǔn)確地選取了AOI，下面的測量分析 就好辦了。在其他的測量軟件中，選擇這種不規(guī)則的區(qū)域一般只能用手拖著鼠標(biāo)來畫，而在IPP程序里，可以通過設(shè)置顏色范圍讓電腦來幫助你選擇這些不規(guī)則區(qū) 域，這樣的選擇就準(zhǔn)確多了?？梢哉f，使用IPP的要點就是靈活地使用各種AOI工具準(zhǔn)確地把那些需要測量的區(qū)域給挑選出來。
對不同的圖片，需靈活地使用各種適當(dāng)?shù)腁OI工具，先用最簡單的，當(dāng)然，簡單的工具只能作簡單的事，就這張圖片來說，用簡單工具選黃色有點困難，我們先用它來選擇藍色的細胞核吧。
點擊measure---count/size,彈出分類測量窗口。
在窗口中選中manual,再點擊select color,彈出顏色選擇窗口segmentation,這個工具是IPP最有特色的顏色選取工具之一。用好這個工具是使用IPP的要點。
對于目標(biāo)顏色鮮明的圖片，用吸管工具是最簡單的。點一下吸管圖標(biāo)，在目標(biāo)區(qū)域點一下，就可以選中該點的顏色，當(dāng)然一下是不可能完全選中所需要指定的全部區(qū)域，可以在未選中的地方接著再點，這樣多次選取，直到把想選中的區(qū)域全部選中為止。
在這張示例圖中，選中的藍色細胞核部分被標(biāo)上了紅色。
用紅框圈起來的四個工具按紐分別是:吸管、撒消上一步操作、橡皮擦、全部清除。下在的小方框里則是吸管位置的選取顏色。
圖片中被標(biāo)上紅色的區(qū)域被定義為一個class,其中每一個獨立的小區(qū)塊被定義為這個class中的一個object。以此圖為例，圖中深藍色的部分是細胞核，因此所有的細胞核都被選中成一個class，其中每一個細胞核就是一個object。
選取完AOI后，點擊close回到count/size窗口，下一步就可以對選中的object進行測量操作了。
點擊count/size窗口中的measure菜單，點select measure，這是選擇要進行何種測量操作，在彈出的測量選擇窗口左側(cè)列出了各種可用的測量選項，最常用的測量有:
area面積
density(mean)平均光密度
diameter直徑
IOD(integrated optical density)累積光密度
在相應(yīng)的項目上點一下，該測量項目就被選到中間的窗口中了，同時關(guān)于該測量的詳細說明會顯示在最右邊。如果想取消某個已選中的測量項目，則在左邊窗口中該項目上再點擊一下就可以了。
選好了待測量的區(qū)域，也指定了測量項目，就可以進行測量統(tǒng)計了，點擊一下測量選擇窗口的OK紐，關(guān)閉這個窗口，就回到了count/size窗口，再點擊一下count按紐，就可以看到程序在進行測量，稍等幾秒鐘即可讀取測量數(shù)據(jù)。
分 別點擊count/size窗口中view菜單中的measurement data和statistics，就分別彈出這兩個數(shù)據(jù)窗口。前者是這個calss中每一個object的測量數(shù)據(jù)，后者是這些測量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計參數(shù)，如總 數(shù)、平均值、累加、標(biāo)準(zhǔn)差等。本例中得到的就是每個細胞核的面積、平均光密度值、直徑、累積光密度值。統(tǒng)計數(shù)據(jù)則可得到這張圖片中所有細胞核的平均面積、 平均光密度值，平均直徑、累積光密度值，當(dāng)然還有細胞核的數(shù)目，就是所有object的數(shù)目。
測量數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)入EXCEL處理起來最方便。只要在數(shù)據(jù)菜單中點file - DDE to EXCEL。數(shù)據(jù)就傳到EXCEL的sheet1里去了。
在這個示例圖片的統(tǒng)計數(shù)據(jù)中
samples為圖中所有細胞核的個數(shù)。
第一列為area,其中的Mean值為各個核的平均面積，后面就是平均灰度、平均直徑，這些是有意義的測量統(tǒng)計數(shù)值。但IOD卻是SUM值更有意義。
訂正:
在上述操作中漏掉了一個重要步驟，就是要轉(zhuǎn)換圖象intensity格式。
在默認的intensity格式中，是圖片灰度，越黑數(shù)值越小，越白數(shù)值越大。而實際上我們測量的染色強度是光密度，染色越深，光密度值越大。
如果不進行光密度單位的轉(zhuǎn)換，測量的數(shù)值將完全是錯誤的。
轉(zhuǎn)換光密度單位的方法如下:
點擊:measure--carliberation--intensity，調(diào)出intensity校正窗口。
然后在窗口中點new按紐，再點一下下面的std optical density選項，這時可以看到窗口中的直線變成了反向的曲線。
然后還要點一下最上面的system按紐。
最后點close關(guān)閉窗口。
這樣就把程序系統(tǒng)的灰度單位轉(zhuǎn)換成了光密度單位。
關(guān)于光密度較正的詳細內(nèi)容請參見第十帖及第十一帖。
校正光密度單位的操作要在打開第一張圖片后立即進行。將光密度單位設(shè)定為system之后就不必再對后面的每一張照片都進行光密度校正了。
整個分析測量過程就是這樣。當(dāng)然，光知道這一點是遠遠不夠的。在以上所述各個步驟中有許多技巧和方法能使測量數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確合理。本人將另發(fā)帖子分別詳細敘述。歡迎大家提問。此主題到此結(jié)束。
小問題：OD與IOD
IOD=density(mean) * Area
density反映了陽性蛋白的濃度或強度，但IOD能反映選定區(qū)域的蛋白表達總量。
一個典型的示例是:陽性樣品切片中有大片的黃色區(qū)域，而陰性切片上只有少量的黃色區(qū)域，但是兩者的黃色都很深。這樣測量的陰性切片與陽性切片的黃色區(qū)域的density mean就沒有差異，差異在于其黃色區(qū)域的面積上。
如果是一個不典型的圖片呢:一個黃色深但面積較小，另一個黃色淺卻面積較大，那一個蛋白表達更強?這時用IOD就更準(zhǔn)確了。
