從恐龍時(shí)代到人類(lèi)現(xiàn)代文明，自然界生命萬(wàn)物無(wú)時(shí)無(wú)刻不在進(jìn)化發(fā)展、繁衍生息。生物進(jìn)化的基本環(huán)節(jié)可概括為：突變、選擇（海選/選撥）、隔離（優(yōu)秀選手單獨(dú)培養(yǎng)）、優(yōu)良性狀的脫穎而出或物種形成。在這個(gè)過(guò)程中，隨機(jī)的基因突變一旦發(fā)生，就受到自然選擇的作用，但是新性狀特征的穩(wěn)定或物種的形成則可能需要上萬(wàn)年時(shí)間的演化。
隨著科學(xué)的進(jìn)步和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，科學(xué)家們不禁設(shè)想：是不是可以在實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)造出各種可能的基因突變組合，來(lái)模擬和加速自然進(jìn)化和篩選的過(guò)程？按需設(shè)計(jì)，對(duì)癥篩選，快速得到我們想要的功能為人類(lèi)造福呢？
帶著這種思考，美國(guó)加州理工大學(xué)的Frances H. Arnold教授率先將這種想法付諸于實(shí)施，用于生物酶的定向進(jìn)化（Directed evolution），并在綠色化工、生物能源、醫(yī)藥等領(lǐng)域取得了一系列開(kāi)創(chuàng)性成果。她本人也因此獲得2018年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。下面我們就來(lái)看看這項(xiàng)革新性技術(shù)是怎么運(yùn)作，以及它對(duì)人類(lèi)生產(chǎn)生活做出了哪些美好貢獻(xiàn)吧！
圖1 自然進(jìn)化到實(shí)驗(yàn)室定向進(jìn)化（圖片來(lái)源：諾貝爾獎(jiǎng)委員會(huì)（左）；FH Arnold, 2018 (右)）
如何實(shí)現(xiàn)生命載體——蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化
蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的執(zhí)行者。酶（enzyme）也是一種蛋白質(zhì)，是生物體內(nèi)的高效催化劑，生命體進(jìn)化了形形色色、功能各異的酶和蛋白質(zhì)催化細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)反應(yīng)和新陳代謝過(guò)程（如食物的消化，毒物的分解，養(yǎng)分的合成，植物的光合作用等）。這些反應(yīng)和功能幫助細(xì)胞更好的適應(yīng)其特定的生存環(huán)境，也可被聰明的人類(lèi)利用來(lái)生產(chǎn)各類(lèi)化學(xué)品、抗生素和藥物等，減少化學(xué)合成法的環(huán)境污染問(wèn)題。
然而生物體內(nèi)天然酶的任務(wù)僅為滿足自身生命活動(dòng)所需，無(wú)需提優(yōu)或額外作業(yè)，人類(lèi)若要利用它們進(jìn)行生產(chǎn)和工業(yè)制造，就要改造它們，把它們訓(xùn)練成各行各業(yè)的精英甚至身懷絕技的特種兵。定向進(jìn)化則可以說(shuō)是打造這種精英速成班或特種兵訓(xùn)練營(yíng)的工具。
前面提到，自然進(jìn)化的關(guān)鍵是突變和篩選。同樣，實(shí)驗(yàn)室定向進(jìn)化也是以這兩項(xiàng)技術(shù)為基礎(chǔ)來(lái)運(yùn)作實(shí)現(xiàn)的。定向進(jìn)化是一個(gè)迭代重復(fù)的過(guò)程，包括：初始目標(biāo)蛋白的選定、基因的突變（多樣化）、高效蛋白表達(dá)和篩選策略的制定和運(yùn)行，然后對(duì)篩到的優(yōu)良突變體基因進(jìn)行再次的突變和篩選。多次循環(huán)，優(yōu)中拔優(yōu)，直到獲得滿意的性能，如：提高的酶活性，提高的抗體結(jié)合力，酶底物特異性的改變，甚至創(chuàng)造全新的反應(yīng)類(lèi)型等。
圖2 酶定向進(jìn)化技術(shù)流程圖（圖片來(lái)源：諾貝爾獎(jiǎng)委員會(huì)，作者整理）
那么，如何對(duì)一個(gè)（目標(biāo)蛋白或酶的）基因進(jìn)行突變，構(gòu)建一個(gè)包含它各種可能突變體的基因文庫(kù)呢？這對(duì)科學(xué)家們來(lái)說(shuō)已經(jīng)是“小菜一碟”了，現(xiàn)代分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展已促生了許多成熟可靠的基因突變文庫(kù)構(gòu)建方法，基本1-3天就可以完成突變文庫(kù)的構(gòu)建。
圖3是一些常見(jiàn)的突變體文庫(kù)構(gòu)建方法，1) 易錯(cuò)PCR：即故意在DNA擴(kuò)增時(shí)隨機(jī)引入錯(cuò)配，以獲得該基因的各種突變形式，構(gòu)建隨機(jī)突變文庫(kù)。2）DNA“洗牌”（DNA Shuffling）：將兩個(gè)以上序列和功能相近但來(lái)自不同物種的同源基因（相似度至少>50%）隨機(jī)切成小片段（如：25-100 bp），不同小片段之間互相交錯(cuò)疊搭，重新組裝，形成全新的多種雜合形式的完整基因片段（Stemmer, 1994），這屬于同源重組法，可快速將各個(gè)有益突變進(jìn)行組合，就如同集父母優(yōu)點(diǎn)于一身的孩子。3）對(duì)一些已知結(jié)構(gòu)的蛋白來(lái)說(shuō)，科學(xué)家們還可以有針對(duì)性的選擇那些與功能發(fā)揮最相關(guān)的氨基酸，將它們突變?yōu)槠渌被?，建立”小而精”的基因突變文?kù)達(dá)到快速優(yōu)化酶催化性能的目的（這也叫酶的半理性設(shè)計(jì)），德國(guó)馬普煤炭研究所的Manfred T. Reetz教授是這方面的領(lǐng)軍人物。4）隨著對(duì)酶分子蛋白序列-結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系認(rèn)識(shí)的深入，以及計(jì)算生物學(xué)的發(fā)展，科學(xué)家們也開(kāi)始利用計(jì)算機(jī)來(lái)模擬突變，通過(guò)一系列生物信息學(xué)算法快速準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)各突變體的穩(wěn)定性、活性和底物結(jié)合特性等，從而有選擇性的去建庫(kù)表達(dá)和篩選，將繁重的文庫(kù)遴選工作交給計(jì)算機(jī)進(jìn)行，縮小了人工篩選的范圍。盡管這方面對(duì)計(jì)算的依賴(lài)性很大，目前成功率還不是很高，但相信計(jì)算機(jī)虛擬定向進(jìn)化（in silico-directed evolution）將會(huì)是未來(lái)發(fā)展的一個(gè)重要方向。
圖3 幾種基因突變文庫(kù)的構(gòu)建方法
蛋白表達(dá)和篩選：數(shù)以萬(wàn)計(jì)甚至億計(jì)容量的基因突變文庫(kù)建立后，首先要進(jìn)入細(xì)胞表達(dá)成為功能蛋白才能進(jìn)行篩選和驗(yàn)證。常用的表達(dá)宿主有大腸桿菌，酵母和枯草芽孢桿菌等。進(jìn)入宿主后，含每個(gè)突變體選手的細(xì)胞各自分離，八仙過(guò)海各顯神通（功能）。這時(shí)，面對(duì)海量的突變體選手，簡(jiǎn)便快速高效的篩選方法就像是能夠有效識(shí)別千里馬的伯樂(lè)，是定向進(jìn)化能否成功的關(guān)鍵。
高通量的篩選方法一般通過(guò)濁度、顏色、熒光或化學(xué)發(fā)光等光學(xué)特性達(dá)到快速評(píng)估的目的。比如：根據(jù)酪蛋白平板上形成透明水解圈的大小來(lái)判斷蛋白水解酶活性的高低；利用酶底物或產(chǎn)物自身或與特定試劑反應(yīng)后能呈顯顏色或激發(fā)熒光的特性，根據(jù)顏色或熒光的強(qiáng)弱判斷酶活性的高低；根據(jù)所攜帶熒光報(bào)告因子的發(fā)光強(qiáng)弱將含突變體的細(xì)胞進(jìn)行分揀篩選；甚至還可將每個(gè)突變體的催化反應(yīng)包裹在微小液滴中，當(dāng)液體流過(guò)熒光分揀儀時(shí)將不同突變選手優(yōu)勝劣汰。
這些方法的篩選量可達(dá)104-109（如微液滴法）個(gè)突變體，我們可以根據(jù)不同需要來(lái)量身定制。當(dāng)然，也并不是所有的化學(xué)反應(yīng)都能夠找到快速高效的篩選方法，因此，針對(duì)不同蛋白、不同的功能和特性，科學(xué)家們還在努力不斷開(kāi)發(fā)出更多、更先進(jìn)的篩選方法。這樣，經(jīng)過(guò)幾輪的定向進(jìn)化淘選，初試和復(fù)試，出類(lèi)拔萃的選手就會(huì)脫穎而出。
圖4 常用定向進(jìn)化文庫(kù)篩選方法（圖片來(lái)源：Packer & Liu，2015。作者整理）
定向進(jìn)化技術(shù)的應(yīng)用——對(duì)人類(lèi)生產(chǎn)生活的貢獻(xiàn)
定向進(jìn)化自發(fā)展以來(lái)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科研、綠色化工和制藥行業(yè)。不僅用于提升酶已知的催化特性，以更加綠色環(huán)保的方式來(lái)生產(chǎn)塑料、農(nóng)藥、燃料等；還賦予酶催化自然界從未有過(guò)的化學(xué)反應(yīng)的能力，使其在工業(yè)上具有更廣泛的應(yīng)用潛力。如：
提高酶在特殊環(huán)境下的穩(wěn)定性和活性：1993年，定向進(jìn)化技術(shù)開(kāi)創(chuàng)者Arnold教授，對(duì)枯草桿菌蛋白酶E進(jìn)行多輪易錯(cuò)PCR隨機(jī)突變，使其在有機(jī)溶劑DMF中穩(wěn)定性增強(qiáng)，活性提高了256倍。就如同給該酶披了件鐵布衫使其在惡劣的有機(jī)工業(yè)環(huán)境中仍能孜孜不倦的工作，大大提高了其合成藥用高分子化合物多聚-L-甲硫氨酸的能力。
改變酶的底物或產(chǎn)物范圍：類(lèi)胡蘿卜素具有抗氧化活性，在抗腫瘤或慢性疾病治療方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。Arnold團(tuán)隊(duì)對(duì)類(lèi)胡蘿卜素合成途徑進(jìn)行定向進(jìn)化，利用DNA洗牌術(shù)改造八氫番茄紅素去飽和酶，首次在大腸桿菌中合成新型非天然類(lèi)胡蘿卜素化合物。2018年P(guān)awlowski等改造大環(huán)內(nèi)酯激酶的底物特異性，成功合成新型抗生素前體。2011年Bastian等改造異丁醇生物合成途徑中的酶，使異丁醇以100%的理論產(chǎn)率合成，用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)異丁醇生物燃料。
改變酶的對(duì)映體選擇性：Arnold團(tuán)隊(duì)通過(guò)反轉(zhuǎn)海因酶的對(duì)映體選擇性來(lái)合成L-甲硫氨酸，Pavlidis等通過(guò)改造轉(zhuǎn)氨酶的活性和立體選擇性合成手性胺等，均對(duì)工業(yè)生產(chǎn)和制藥行業(yè)具有重要意義。
抗體的定向進(jìn)化：定向進(jìn)化在抗體親和力改造和抗體藥物篩選方面也取得了很大成功。如2002年FDA批準(zhǔn)上市用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的阿達(dá)木抗體即是利用進(jìn)化篩選來(lái)的人源化抗體，徹底解決了異源抗體的免疫排斥問(wèn)題。
催化新的化學(xué)反應(yīng)：2016年Ellefson等曾通過(guò)定向進(jìn)化賦予了逆轉(zhuǎn)錄酶幾十億年來(lái)所沒(méi)有校對(duì)糾錯(cuò)功能。Arnold等對(duì)P450酶的改造賦予了該類(lèi)酶一系列催化全新反應(yīng)的能力，如：雜環(huán)烯烴的卡賓反應(yīng)，反馬氏烯烴氧化反應(yīng)和不對(duì)稱(chēng)合成烯丙胺的反應(yīng)等，在生物燃料、化工合成和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
最引人注目的是“女神”Arnold團(tuán)隊(duì)2016年改造細(xì)胞色素C氧化酶，使其具備了前所未有的“碳-硅”鍵形成能力，將硅元素引入生命有機(jī)體。該重大發(fā)現(xiàn)除了可以更經(jīng)濟(jì)環(huán)保的方式生產(chǎn)有機(jī)硅化合物，應(yīng)用于制藥、半導(dǎo)體等行業(yè)，還一度引起不少人驚呼構(gòu)建“硅基生命”的可能性。
圖5 細(xì)胞色素c突變體的血紅素蛋白在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)催化碳-硅 (C-Si) 鍵形成，室溫高效合成有機(jī)硅化合物（圖片來(lái)源：Kan et al, Science，作者整理）
目前地球上發(fā)現(xiàn)的生命有機(jī)體皆是以碳元素為基礎(chǔ)的碳基生命，那些出現(xiàn)在科幻小說(shuō)和電影中的地外生命形式有朝一日會(huì)出現(xiàn)在我們的生活中嗎？硅基生命真的可能存在嗎？或許我們對(duì)地外生命形式的認(rèn)識(shí)正在拉近，這些問(wèn)題將會(huì)由未來(lái)的科學(xué)家們?nèi)ヌ剿鳌l(fā)現(xiàn)和創(chuàng)造。
酶和蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化現(xiàn)已成為生物工程領(lǐng)域的“硬核”技術(shù)手段，不僅加深了我們對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的認(rèn)識(shí)，也為人類(lèi)生活帶來(lái)了福祉。它不僅可以針對(duì)某一蛋白進(jìn)行改造，還可以改善細(xì)胞代謝途徑、優(yōu)化代謝網(wǎng)絡(luò)、獲得期望表型的細(xì)胞，是將來(lái)合成生物學(xué)開(kāi)發(fā)更多、更精確的功能元件，設(shè)計(jì)組裝新生物系統(tǒng)強(qiáng)有力的工具。正如Arnold所說(shuō)“我們?cè)诮堂溉绾芜M(jìn)化的同時(shí)，自身也在不斷學(xué)習(xí)進(jìn)步”。
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來(lái)源：中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所
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