2018年諾貝爾化學獎頒給了三名生物化學專家。美國科學家弗朗西斯·阿諾德(Frances H. Arnold)獲得一半化學獎，以表彰她實現(xiàn)了酶的定向進化；美國科學家喬治·史密斯(George P. Smith)和英國科學家格雷戈里·溫特爾(Gregory P. Winter)分享另一半，以表彰他們實現(xiàn)了多肽和抗體的噬菌體展示技術。
作為酶催化領域，尤其是分子定向進化的先驅(qū)，F(xiàn)rances H. Arnold教授名字可謂是如雷貫耳。正是由于她率先在該技術上的突出成就，才造就了生物催化第三次浪潮，使得酶促生物合成進入了全新的時代——酶分子定向進化。
生物催化劑——酶
在具體介紹這項技術之前，請允許我先介紹一些背景知識，以便大家更好地理解。
酶分子定向進化技術是酶催化領域上游核心技術之一。那么，首先我們得清楚什么是“酶”。
我們知道，自然界所有的物質(zhì)都可以看做是由原子構成的大大小小的分子，小分子包括氧氣（O2）和水（H2O），僅由幾個原子構成，大分子到由幾萬、幾十萬原子（通常用kDa為單位）構成的蛋白質(zhì)分子。
然而，從一個化學分子到另一種化學分子，伴隨著一些化學鍵的生成和解離，在這個過程中有些可以自發(fā)生成，但大多數(shù)情況下需要在特定的條件下才能發(fā)生。
有一些科學史知識的朋友，一定知道著名的“米勒模擬實驗”：即模擬在原始地球還原性大氣中進行雷鳴閃電能產(chǎn)生有機物（特別是氨基酸），以論證生命起源的化學進化過程。
所以，在化學合成中，高溫、高壓是常見的反應條件，因為反應中需要輸入足夠的能量才能使反應得以進行。為了讓化學反應能夠更高效地進行，自然界有她獨特的方法——催化劑。
一般催化劑，包括酸堿、金屬、過渡金屬和過氧化物等。但在眾多催化劑中，有一種特別突出，那就是酶，它是一種極為高效的特殊催化劑，其化學本質(zhì)是具有催化活性的蛋白質(zhì)或核酸。
酶相比較一般催化劑（通常是化學催化劑），其高效的原因就在于它能更大幅度的降低反應活化能，讓反應從底物（原料）到產(chǎn)物更容易進行（如上圖）。
酶，日本和臺灣地區(qū)也叫酵素（學術上定義和產(chǎn)業(yè)定義不同，這里暫不贅述），是大自然饋贈給我們最好的禮物?？梢哉f，所有生物正是由于酶這種天然生物催化劑才得以生存繁衍。
正是由于酶如此重要的地位，才造就了近20位和酶學研究相關的諾貝爾獎得主，而本次Frances H. Arnold教授的獲獎再為酶學領域新添了一枚獎章。
截止今日，根據(jù)BRENDA數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計，已經(jīng)有7511種酶被收錄，并賦予EC號碼（國際酶學委員會編號）。
酶催化
酶催化，通常我們稱生物酶催化，也常被稱為“生物催化”。
生物催化（biocatalysis）是指利用酶或者生物有機體（細胞、細胞器、組織等）作為催化劑進行化學轉化的過程，這種反應過程又稱為生物轉化（biotransformation）。
這個時候，我想很多人會把“生物催化”和我們更為熟悉的“發(fā)酵”相混淆。我甚至發(fā)現(xiàn)，有時在專業(yè)領域的一些研發(fā)人員也會分不清這兩個概念。
圖片截選自參考文獻[1]
上圖很好的詮釋了發(fā)酵和生物催化的主要區(qū)別。
左邊即發(fā)酵 (Fermentation），主要通過活細胞（Growing Cells）實現(xiàn)，不管原料是簡單的碳水化合物（De novo fermentation）還是復雜的前體物質(zhì)（Precursor fermentation）;
右邊是生物催化，主要通過死細胞（Dead Cells）實現(xiàn)，不管是全細胞催化（Whole Cells，不進行菌體破碎）還是（游離）酶催化（Cell-free Enzymes，進行菌體破碎并提取酶）。
我們通常將發(fā)酵和生物催化統(tǒng)稱為“生物合成”（Biosynthesis）。但生物催化不管是全細胞催化，還是（游離）酶催化，都是基于酶催化的本質(zhì)，所以酶催化和生物催化名稱混用的現(xiàn)象很常見。
生物催化，其實并不是新鮮事物，和人工智能一樣，它其實也已經(jīng)經(jīng)歷了三次浪潮。
圖片截選自參考文獻[2]
第一次浪潮，大概發(fā)生在一個世紀前，科學家發(fā)現(xiàn)活體細胞的某些成分可以用于化學轉化，但這個時期還停留在實驗室階段，算是生物催化的萌芽階段。
第二次浪潮，發(fā)生在上個世紀八、九十年代，蛋白質(zhì)工程興起，擴寬了生物酶的底物范圍，使得生物催化的領域拓寬到非天然的醫(yī)藥中間體和精細化工領域。但這個時期還主要處于小試規(guī)模，沒有形成大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
第三次浪潮，發(fā)生在上個世紀九十年代中后期，也正是這次諾貝爾化學獎之一的Frances H. Arnold教授等發(fā)明的酶定向進化技術，極大地改變了生物酶催化劑的蛋白質(zhì)工程改造效率。
這項技術的出現(xiàn)，伴隨著基因合成、測序成本的下降以及計算機輔助的分子模擬技術的發(fā)展，使得生物催化技術極大地拓寬了應用價值。這個時期開始，生物催化技術參與的產(chǎn)品工業(yè)化規(guī)模開始出現(xiàn)。
正是由于酶定向進化技術，才使得酶催化技術極大地提高部分化學藥物合成的效率，并順應綠色化學趨勢，創(chuàng)造出了一個又一個舉世矚目的產(chǎn)業(yè)神話！所以，本次諾貝爾化學獎頒給這項技術也是眾望所歸！
部分酶催化藥物合成著名產(chǎn)業(yè)化案例
酶工程
現(xiàn)在我們知道，酶的本質(zhì)是具有催化作用的蛋白質(zhì)或核酸（核酶的發(fā)現(xiàn)也是諾獎之一，但囿于篇幅，以下所涉及的酶均指蛋白性質(zhì)的酶）。
酶作為蛋白質(zhì)大分子，通常只有在生物體內(nèi)才能行使高效的催化活性，在生物催化技術發(fā)展早期，從生物體內(nèi)提取的酶通常很不穩(wěn)定，再加上其生產(chǎn)成本高昂，在相當長時間內(nèi)僅限于實驗室研究，離產(chǎn)業(yè)化非常遙遠。
為了解決酶本身的諸多問題，科學家們做了相當長時間的努力和探索，我們稱之為“酶工程改造”或者“酶工程”。順便提一下，學術界一般更偏向使用“蛋白質(zhì)工程” （Protein Engineering），因為方法一樣，只是后者涵蓋非酶類蛋白質(zhì)（比如功能性蛋白），覆蓋面更廣。
從分類來看，我會將酶工程分為狹義的酶工程和廣義的酶工程。
狹義的酶工程包括：
理性設計：人工設計（定點突變、從頭設計等）
非理性設計：定向進化（隨機突變）
半理性設計：人工選定位置或區(qū)域內(nèi)的隨機突變
廣義的酶工程包括以下三個方面：
酶的分子改造工程：即狹義的酶工程
酶的化學修飾工程：酶固定化、PEG化等
酶的溶劑開發(fā)工程：穩(wěn)定劑、激活劑、抑制劑等添加與配伍等
從上述分類看出，其實酶分子定向進化技術只是酶工程改造中的一個小的分支。但即便如此，由于它獨特的優(yōu)勢，已經(jīng)成為學術界和工業(yè)界酶工程改造領域中的通用技術，和其他技術相比其影響不可同日而語。
定向選擇與進化
達爾文老先生曾經(jīng)說過“物競天擇、適者生存”。進化論自清末赫胥黎的《天演論》進入中國，由當時的康有為、梁啟超極為推崇后，就在中國廣為傳播。自此，《物種起源》所闡釋的基本理論在歷史的長河中雖屢遭沖擊，但一直屹立不倒。
達爾文的進化論在闡釋物種進化遵循一些前提和假設，而這套理論可以很容易利用下面這張循環(huán)圖來解釋。
當環(huán)境發(fā)生惡劣變化后，物種繁殖的后代中出現(xiàn)了少數(shù)變異，這些變異者比非變異者更適合變化后的惡劣環(huán)境，于是它們被環(huán)境選擇，存活了下來，原來的變異被固化，從而實現(xiàn)了物種的進化。后來，新一輪環(huán)境變化發(fā)生，變異、選擇和進化的循環(huán)再次開啟。
這個基本模型就是達爾文進化論的核心。
上過高中生物課的朋友也許還有印象。生物體的外在性狀主要是由蛋白質(zhì)體現(xiàn)出來的，而蛋白質(zhì)的產(chǎn)生遵循“中心法則”，如下圖所示。
“中心法則”表明基因決定性狀。
但是性狀最終是否被表達和留存取決于環(huán)境，因為所有的表型都是基因和環(huán)境作用的結果，用一個簡單公式來表達就是：
P （Phenotype）= G (Gene) x E (Environment)
結果我們之前達爾文的進化論模型，就可知道：
所有的變異都源自基因的變化，所有的進化都是基因適應環(huán)境的效應。
復旦大學生態(tài)與進化生物學系主任盧寶榮教授曾舉過一個斑點蛾（Peppered Moth）的例子，非常契合宏觀層面（物種）定向選擇和進化的理論。
之前沒有被污染的環(huán)境下，大部分的斑點蛾都是白色的，黑色的蛾子特別少，因為容易被天敵發(fā)現(xiàn)無法生存；但環(huán)境被污染后，顏色變深，原先白色的蛾子更容易被天敵捕獲，而黑色的蛾子反而生存下來，由此黑色的蛾子數(shù)量急劇增加。
正是由于不同環(huán)境的選擇，斑點蛾的顏色變化頻率和數(shù)量才發(fā)生了巨大的變化，并且進一步的研究表明這正是由于其顯色的基因突變所致，這就是所謂的定向選擇，進而實現(xiàn)定向進化。這也正是達爾文進化理論的典型證據(jù)。
酶分子定向進化
終于到了“酶分子定向進化”技術。有了前面的基礎，理解起來就非常容易了。
酶分子的定向進化技術的萌芽可以追溯到上個世紀60年代，由美國分子生物學家Sol Spiegelman利用RNA噬菌體Q第一次在分子水平上定向改造了單一分子開啟。
1993年，正是本次諾貝爾化學獎獲得者之一的美國科學家Frances H. Arnold首先提出酶分子的定向進化的概念，提出易錯PCR（error-prone PCR）方法用于天然酶的改造或構建新的非天然酶。
這也是為什么參與并建立酶定向進化研究者不少，但諾貝爾獎化學獎在酶分子定向進化技術上僅頒給Arnold教授的原因。
自此，酶分子定向進化技術得到了前所未有的發(fā)展和進步。
這里，如果我們把物種的定向選擇和定向進化縮小到酶蛋白分子水平，我們就很容易理解這項技術的概念了。
在試管中模擬達爾文進化過程，通過隨機突變和重組，人為制造大量的突變，按照特定的需要和目的給予選擇壓力，篩選出具有期望特征的蛋白質(zhì)（酶），實現(xiàn)分子水平的模擬進化。
文字不夠，我們就上圖：
具體來說，首先得在酶蛋白基因水平上盡可能多地人為造成隨機突變或重組，形成一個龐大的基因突變庫，然后在基因表達出相應的酶蛋白突變體庫。
然后，在人工模擬惡劣環(huán)境或要求下（比如高溫、高毒性）從酶蛋白突變體中定向篩選出具備理想性狀的酶蛋白突變體（比如高活性、高選擇性、高穩(wěn)定性等）。
最后，從篩選出的酶蛋白突變體中提取基因，并作為母本，進入下一輪酶基因突變庫建立，實現(xiàn)酶的進化。
這就是我們在實驗室模擬達爾文進化過程，實現(xiàn)酶蛋白定向進化的基本步驟！
自酶定向進化技術發(fā)明以來，至今為止已經(jīng)衍生出相當多的細分技術，但是無論如何發(fā)展，都可以歸結為兩大方面：基因突變庫建立和高通量篩選。
基因突變庫的建立方法目前在國內(nèi)主流的依然是易錯PCR（error-prone PCR）。
通過改變PCR反應條件來調(diào)整PCR反應中的突變頻率，降低聚合酶固有的突變序列的傾向性，提高突變譜的多樣性，使得錯誤堿基隨機地以一定的頻率摻入到擴增的基因中，從而得到隨機突變的DNA文庫。
為了進一步提高不同策略易錯PCR方法的選擇，我原先所在的課題組還專門開發(fā)了易錯PCR策略選擇分析工具——MAP。
除了易錯PCR方法，基因突變庫建立方法層出不窮，還包括：
DNA shuffling
SeSaM
StEP
ITCHY
RACHITT
SCRATCHY
...
其中DNA重排（DNA shuffling）也是使用比較廣泛的一項基因突變建庫方法。
我博士期間實驗組發(fā)明的SeSaM (Sequence Saturation Mutagenesis，序列飽和突變），是一種基于序列飽和隨機突變的建庫方法。
它不僅可以避免常規(guī)隨機突變偏差，另一方面由于該方法引入了通用堿基，可以對特定序列進行很好的堿基替換控制，是一種更優(yōu)的建庫方法。
然而，建庫方法固然重要，但沒有合適的高通量篩選的方法也是無濟于事。
目前常見的高通量篩選方法包括：
Solid phase screening (平板篩選法）
Microtiter plate scrreing (微孔板篩選法）
Flurorescence-Activate Cell Sorting (FACS法）
三種方法一次性篩選能力（“通量”）各不相同，平板篩選最高為10^4，微孔板篩選最高為10^5，F(xiàn)ACS通過流式細胞儀可以超過10^7，但各自都有其優(yōu)缺點。目前國內(nèi)最為常用的還是微孔板篩選法。
值得一提的是，本屆諾貝爾化學獎頒發(fā)給另外兩位，以表彰其噬菌體展示技術在多肽和抗體上的應用，其實也可以用于酶突變庫高通量篩選，由于篇幅有限，這里不做介紹。
經(jīng)過20多年的發(fā)展，酶分子定向技術成果豐厚，除了之前我提及其在化學藥生物催化合成領域巨大的產(chǎn)業(yè)化成就外，在方法論領域也是百發(fā)齊放，不斷進化。
近幾年，酶分子定向進化技術已經(jīng)從原來的1.0時代進入了2.0時代。由于生物信息學的發(fā)展，海量關于序列和結構數(shù)據(jù)被獲取，計算機輔助設計和基于結構信息的分析水平進一步提高，從而使得現(xiàn)有的酶分子進化策略越來越采用聯(lián)合方法實施，并取得了更為明顯的效果。
拿KnowVolution為例，可以通過以下4步酶分子改造策略的進一步優(yōu)化：
傳統(tǒng)定向進化：經(jīng)過數(shù)輪建庫和篩選，找出潛在有益突變點。
定點飽和突變和篩選：對有益突變點進行飽和突變，發(fā)現(xiàn)更多有益取代。
計算機模擬分析：通過3D建模、分子對接和分子模擬等技術，分析有益取代基團特性，提出分子機制，并決定最終氨基酸殘基組合的位點。
優(yōu)勢位點組合：將經(jīng)上述分析優(yōu)勢取代位點進行組合，產(chǎn)生超級突變株。
最后，我想介紹一下我熟悉的酶定向進化專業(yè)實驗室。
相信隨著酶定向進化技術獲得諾獎，生物催化領域?qū)⑦M一步得到推動，進入人們的視野。作為依然從事在酶和酶催化領域的研究者，我有信心，將這一事業(yè)推向新的高度！
參考文獻
[1]. Sheldon, R. A., & Brady, D. (2018). Chemical Communications, 54(48), 6088–6104.
[2]. Bornscheuer, U. T., Huisman, G. W., Kazlauskas, R. J., Lutz, S., Moore, J. C., & Robins, K. (2012). Nature, 485(7397), 185–194.
[3]. T. S. Wong, K. L. Tee, B. Hauer, U. Schwaneberg, Nucleic Acids Res 2004, 32, e26
[4]. Verma, R., Schwaneberg, U., & Roccatano, D. (2012). ACS Synthetic Biology,1(4), 139–150.
[5]. Cheng, F., Zhu, L., & Schwaneberg, U. (2015).. Chemical Communications,51(48), 9760–9772.
