出芽式血管（SA）生成過程中擴展的血管網(wǎng)絡(luò)需要對許多細胞功能的協(xié)調(diào)控制，包括靜態(tài)內(nèi)皮細胞（EC）的激活，細胞突起，基底層和細胞外基質(zhì)降解，細胞遷移和增殖，沉積新基底膜，細胞連接和細胞極性改變的過程。
血管內(nèi)皮生長因子-A（VEGF-A）是最重要的細胞因子，可激活維持該形態(tài)發(fā)生過程的遺傳程序。
miRNA是一類小的非編碼RNA，通過靶向蛋白質(zhì)編碼基因的mRNA，導(dǎo)致mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)的表達，進而廣泛調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達。
調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中有miRNA，可以使細胞在不同細胞狀態(tài)下轉(zhuǎn)換。
miR-15a and miR-16抑制VEGF，miR-27b和miR-221維持細胞特異性分化
使用3D模型模擬出芽式血管生成在體外初始階段，ECs誘導(dǎo)形成成橢球體，左圖（SPHC）不加VEGF-A培養(yǎng)，為對照組；右圖（SPHV）加入VEGF-A培養(yǎng)，為實驗組。
圖1A：發(fā)現(xiàn)對照組（SPHC）沒有血管生成，而實驗組（SPHV）有出芽。
圖1B：對比兩組實驗進行基因表達分析，有3071個基因在VEGF-A處理后表達差異，說明在出芽式血管增值初期整體轉(zhuǎn)錄組有很大差異。其中主要為VEGFR2上調(diào)。對比兩組實驗的尖端細胞和莖細胞基因，表達發(fā)現(xiàn)實驗組（SPHV）尖端標記基因大部分上調(diào)，莖細胞標記下調(diào)。
圖1C：GSEA分析實驗組和對照組的核心生物學通路和出芽式血管生成相關(guān)基因的變化，發(fā)現(xiàn)”VEGF-A應(yīng)答上調(diào)基因“，“翻譯”，“細胞粘附分子”，“整聯(lián)蛋白途徑”，“細胞外基質(zhì)組織”和“膠原形成”的主要基因都在實驗組（SPHV）富集。
圖2A：GSEA分析VEGF-A處理前后細胞周期控制基因，發(fā)現(xiàn)細胞周期調(diào)控基因富集于對照組（SPHC），即預(yù)示VEGF-A處理導(dǎo)致細胞不增殖。
圖2B：KEGG信號通路分析VEGF-A處理前后細胞周期基因的表達，發(fā)現(xiàn)處理后細胞周期相關(guān)的52個差異基因有50個表達下調(diào)。
圖2C：GSEA分析嘧啶表達富集于對照組（SPHC），圖2D：GSEA分析VEGF-A處理后嘌呤表達也富集于對照組（SPHC），即DNA合成受阻。
圖2E：測定PPAT酶、CAD酶和ATIC酶活性。其中PPAT酶和CAD酶為嘌呤和嘧啶核苷酸從頭合成的標記物；ATIC酶催化嘌呤合成的最后一步。發(fā)現(xiàn)VEGF-A降低了3D模型中這三種酶的活性。（濕實驗）
圖2F：使用EdU+測定細胞分裂S期細胞含量，發(fā)現(xiàn)SPHC處于細胞靜止狀態(tài)，而VEGF-A不能使橢球體18小時內(nèi)顯著增殖（濕實驗）
圖2G：使用絲裂霉素C使內(nèi)皮細胞有絲分裂停止（右圖），但是相對左圖未處理的，仍然保持遷移和形成內(nèi)皮出芽的能力。
即通過濕實驗驗證了早期VEGF-A處理沒有細胞增殖。
因此，作者通過GSEA分析、KEGG分析、實驗室檢驗等方法，證實了在3D條件下，早期VEGF-A活性主要是針對細胞遷移而不是細胞增殖。
通過小RNA測序注釋出內(nèi)皮細胞兩種實驗條件下639個水平高于閾值的成熟miRNA；
圖3A：miRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建流程，通過miRNA和蛋白質(zhì)編碼基因共表達分析、miRNA靶基因預(yù)測、miRNA生物學關(guān)聯(lián)和通路分析，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄后網(wǎng)絡(luò)。
圖3B：配對因子相關(guān)性分析：將miRNA和編碼蛋白質(zhì)表達式配對，并繪制Pearson系數(shù)。同時，使用TargetScan預(yù)測將miRNA由基因突變情況分成保守型和非保守型，再劃出保守型相關(guān)系數(shù)（藍色線條），成對的miRNA-蛋白質(zhì)編碼基因相互作用（紅色線條），1000個有序樣本隨意化得到無效假設(shè)（灰色線條），發(fā)現(xiàn)保守型miRNA與編碼的蛋白質(zhì)呈負相關(guān)。即保守型miRNA上調(diào)，蛋白質(zhì)編碼基因靶位表達下調(diào)。
圖3C：GSEA分析miRNA和特定通路調(diào)控基因的關(guān)系
圖3D：GSEA分析結(jié)果：確定了5類基因組。（1）細胞外基質(zhì)重塑和細胞遷移、（2）蛋白質(zhì)翻譯和代謝過程、（3）細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑、（4）RNA和蛋白質(zhì)加工、（5）細胞周期中DNA修復(fù)和MAPK級聯(lián)
圖4：將上面分析五個聚類生成維持出芽式血管生成的整體轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，左側(cè)為上調(diào)的miRNA導(dǎo)致靶蛋白下調(diào)網(wǎng)絡(luò)，右側(cè)為下調(diào)miRNA導(dǎo)致靶蛋白上調(diào)網(wǎng)絡(luò)。
VEGF介導(dǎo)的EC增殖由ERK通路調(diào)控和遷移由p38 MAP激酶調(diào)控，因此進一步研究miRNA是否調(diào)控ERK和MAP通路
圖5A：提取miRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控和MAP激酶相關(guān)的節(jié)點和靶向的miRNA，這個網(wǎng)絡(luò)涵蓋幾種抑制對MAP激酶的miRNA。
圖5B：實時PCR分析SPHC和SPHV中MAP激酶家族的主要成員，驗證了實驗組（SPHV）MAPK14上調(diào)，RAF1，MAP2K1，MAPK1和TAOK1下調(diào)
圖5C：通過Meso Scale Technology測定ERK通路活性，發(fā)現(xiàn)VEGF使ERK通路活性降低
圖5D：通過電鏡觀察使用ERK抑制劑（上圖）和p38抑制劑（下圖）后，對形成新芽遷移和遷移無影響，發(fā)現(xiàn)抑制ERK通路對遷移無影響，而抑制p38后形成新芽遷移和遷移能力降低。
因此，miRNA調(diào)控增殖和遷移通過ERK和MAP通路。
DICER為核酸內(nèi)切酶，調(diào)控miRNA，敲減后無法形成成熟的miRNA。
圖6A：敲減DICER后，VEGF-A增加導(dǎo)致MAP激酶增加，原本VEGF-A增加MAP激酶減少。
圖6B：敲減DICER后，VEGF-A增加導(dǎo)致ERK通路略微活性上調(diào)，原本活性下調(diào)。
圖6CD：敲減DICER后，對EC形成新芽和遷移能力下降（圖C上下對比）；同時， 敲減DICER后使EC對ERK抑制劑更加敏感（圖C下圖左右對比）
圖6E：GSEA分析敲減DICER和野生型DICER在基因表達譜，發(fā)現(xiàn)敲減DICER在VEGF-A刺激條件下細胞周期和核苷酸代謝相關(guān)基因高于未野生型水平。
圖6F：EdU測定有絲分裂S期細胞比重，敲除后S期占比高，即VEGF-A依賴性的細胞增殖增加。
通過之前的文獻報道挑選血管控制相關(guān)的 miR-424–5p 和 miR-29a-3p進行生物學驗證。
圖7AB：展示miR-424–5p 和 miR-29a-3p在調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中控制的基因，其中miR-424–5p和MAPK通路以及細胞周期相關(guān)，而miR-29a-3p則和細胞重塑相關(guān)
圖7CD：使用外源的DAPT（DDL4的抑制劑）和DDL4（在血管生成中高表達的基因），DAPT上調(diào)miR-424–5p 而下調(diào)miR-29a-3p；DDL4則相反。
圖7EF：通過使用miR-424–5p 和 miR-29a-3p的模擬物上調(diào)或者使用抑制劑下調(diào)miR-424–5p 和 miR-29a-3p的水平，發(fā)現(xiàn)無論上調(diào)下調(diào)均損害了EC的血管出芽能力，表明miR-424–5p 和 miR-29a-3p在合適范圍內(nèi)才最佳。
圖7GH：通過miR-424–5p 和 miR-29a-3p的模擬物上調(diào)，驗證miR-424–5p 和 miR-29a-3p的靶基因情況，上調(diào)后導(dǎo)致對應(yīng)的靶基因下調(diào)。
通過對miRNA調(diào)節(jié)的整體分析解釋miRNA上調(diào)和下調(diào)的非對稱效應(yīng)。
圖8A：TaqMan陣列分析miR-424–5p 和 miR-29a-3p過表達和低表達時，整體miRNA中有多個miRNA改變。
圖8B：根據(jù)miRNA網(wǎng)絡(luò)篩選出和miR-424-5p或miR-29a-3p有共同靶基因的miRNA，發(fā)現(xiàn)也有大量改變。
作者引入內(nèi)皮細胞細胞評分概念，血管生成中的內(nèi)皮細胞評分高。
圖9A：GSEA分析miR29a-3p與不同內(nèi)皮評分大腸癌之間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR29a-3p靶子集富集在內(nèi)皮評分較高的CRC。
圖9B：網(wǎng)絡(luò)分析上調(diào)的模塊與內(nèi)皮評分正相關(guān)。
圖9C：GSEA分析上調(diào)的模塊與不同內(nèi)皮評分大腸癌的關(guān)系，上調(diào)的模塊富集在評分高的CRC。
圖9D：GSEA分析對VEGF阻斷劑敏感與不敏感與上調(diào)的模塊的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)上調(diào)模塊在VEGF阻斷劑敏感型富集。
最后小結(jié)一下，作者通過對比有無VEGF-A處理培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞，發(fā)現(xiàn)兩組細胞基因表達水平很大差異，且表達的基因在生物學功能上很大不同，進而作者深入研究這種不同表達的機制，發(fā)現(xiàn)有miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控這ECs的表型轉(zhuǎn)換，隨后作者利用miRNA以及兩個血管生成相關(guān)的miRNA過表達或失表達驗證這個模型，最后作者分析了miRNA網(wǎng)絡(luò)與中腫瘤血管生成的關(guān)系。
