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編譯：劉寧，編輯：十九、江舜堯。

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1 正常主動(dòng)脈的單細(xì)胞分布及劃分細(xì)胞類型的標(biāo)志物的鑒定

使用基于液滴的大規(guī)模平行scRNA測(cè)序轉(zhuǎn)錄分析了4種野生型C57/BL6小鼠主動(dòng)脈。以低測(cè)序深度（17000 reads/細(xì)胞）對(duì)2個(gè)主動(dòng)脈進(jìn)行測(cè)序，以高測(cè)序深度（145000 reads/細(xì)胞）對(duì)2個(gè)主動(dòng)脈進(jìn)行測(cè)序。基于測(cè)序深度，簇狀細(xì)胞群體的數(shù)量沒(méi)有差異，所有后續(xù)分析使用的是高測(cè)序深度數(shù)據(jù)，大約檢測(cè)到6200個(gè)細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞1900個(gè)基因（圖1）。在分析之前去除了表達(dá)基因計(jì)數(shù)>4000或<200的細(xì)胞。使用每個(gè)細(xì)胞1100個(gè)可變基因的聚類分析來(lái)識(shí)別具有相似特征的細(xì)胞，將細(xì)胞利用無(wú)監(jiān)督的方法聚類劃分為組（圖1B）。在不同簇中代表的血管細(xì)胞類型包括內(nèi)皮細(xì)胞EC、血管平滑肌細(xì)胞VSMC、動(dòng)脈成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞，以及鄰近組織中的神經(jīng)元簇。檢測(cè)到制備過(guò)程中的少量紅細(xì)胞，被排除在進(jìn)一步分析之外。

細(xì)胞類型特異性標(biāo)志物被定義每種細(xì)胞簇中表達(dá)差異最高的5個(gè)基因（圖1C），即這些基因在該類型的所有細(xì)胞中廣泛表達(dá)，而在其他簇中不表達(dá)。例如VSMC特定標(biāo)志物是Myh11、TPM2、Myl9、Tagln和Acta2。還鑒定了每種細(xì)胞類型中差異倍數(shù)的對(duì)數(shù)> 2的所有基因（圖1D）。其中與其他細(xì)胞簇相比，單核細(xì)胞具有最多的差異表達(dá)基因。

進(jìn)一步劃分：第一種標(biāo)志物在某一細(xì)胞簇的所有細(xì)胞的>75％中表達(dá)，平均標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)>0.75，例如Myh11（VSMC）、C1qa（單核細(xì)胞）和Pecam1（EC），代表了最特異性和最敏感的標(biāo)志物。第二種標(biāo)志物物在細(xì)胞簇中差異表達(dá)但對(duì)此細(xì)胞簇的所有細(xì)胞不敏感，例如Gpihbp1（ECs）和Cd52/Rac2（單核細(xì)胞）。第三種標(biāo)志物物是在一種細(xì)胞簇中高表達(dá)但在其他細(xì)胞簇中也高表達(dá)的基因。

與僅使用少量典型的細(xì)胞類型特異性標(biāo)志物相比，利用所有基因?qū)?xì)胞進(jìn)行聚類更好的檢測(cè)細(xì)胞亞群和細(xì)胞異質(zhì)性。

2 利用轉(zhuǎn)錄組確定主動(dòng)脈細(xì)胞簇的細(xì)胞亞群

通過(guò)聚類定義的10個(gè)獨(dú)立組定義主動(dòng)脈細(xì)胞類型內(nèi)的亞群（圖2A）。成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和EC都聚集成多個(gè)亞群（圖2B），VSMC占所有細(xì)胞的39％，聚集成1個(gè)亞群，表達(dá)典型的VSMC標(biāo)志物Myh11和Cnn1。成纖維細(xì)胞占所有細(xì)胞的33％可以分為兩個(gè)亞組：高表達(dá)Pdgfra和膠原蛋白/膠原蛋白結(jié)合蛋白（Col1a1，Col1a2，Dcn，Lum）以及低表達(dá)與VSMC相關(guān)的收縮蛋白（Myh11，Cnn1）。Cdh5為標(biāo)志物的EC分為3個(gè)不同的亞群，但是某些典型的EC特異性基因，例如von Willebrand因子（Vwf）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（Flt1，Kdr）在不同亞群中表達(dá)差異，不能用作識(shí)別主動(dòng)脈中所有EC的有效標(biāo)志物。免疫細(xì)胞分為3個(gè)廣泛定義的組：巨噬細(xì)胞（H2-Ab1）和2個(gè)單核細(xì)胞亞群（均表達(dá)Lyz2）。基因表達(dá)存在重疊，必須使用多種標(biāo)志物物來(lái)區(qū)分。一小部分細(xì)胞表達(dá)了神經(jīng)元的標(biāo)志物，包括Mbp和Cnp，可能來(lái)自鄰近神經(jīng)元組織的少量污染。其中3個(gè)EC簇是離散的亞群，而兩個(gè)成纖維細(xì)胞簇存在連續(xù)的梯度變化（圖2C）。

之前在大腦的小血管中定義的早期基因標(biāo)志包括Fos、Fosb、Jun和Junb等在本研究中發(fā)現(xiàn)具有相似的表達(dá)量，表明其并不是EC和成纖維細(xì)胞中細(xì)胞異質(zhì)性的解釋。為了探索每個(gè)細(xì)胞的最小測(cè)序reads數(shù)，本研究還在深度更低的scRNA測(cè)序文庫(kù)中進(jìn)行了細(xì)胞類型的聚類和鑒定（每個(gè)細(xì)胞約≈17000個(gè)讀數(shù)），得到數(shù)據(jù)基本相同。

圖2.從單細(xì)胞RNA測(cè)序鑒定的細(xì)胞類型內(nèi)的亞群。

A，t-隨機(jī)鄰近嵌入（t-SNE）分析得到10個(gè)簇。 

B，樹(shù)狀圖總結(jié)了主動(dòng)脈細(xì)胞亞群之間的相似性。

C，鑒定每個(gè)細(xì)胞亞群的標(biāo)志物的熱圖。 

3 三個(gè)EC亞群具有不同的基因表達(dá)譜及不同的功能

ECs是通過(guò)典型標(biāo)志物物Cdh5確定的，用Wilcoxon ranksum分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了新的標(biāo)志物（圖3）。包括血管生成中已知的內(nèi)皮特異性參與者，包括Sdpr、Egfl7、Ptprb和Ecsc以及先前在EC和幾種粘附和轉(zhuǎn)運(yùn)分子（Cldn5 、Icam2 、Slc9a3r2）。使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)和Bonferroni校正，通過(guò)最高差異表達(dá)來(lái)定義每個(gè)亞群的唯一標(biāo)志物（圖4A）。最大的種群（EC 1）是由許多典型的EC標(biāo)志物（Vcam1）和高表達(dá)在EC中具有已知功能的其他基因（例如Clu、Gkn3和Eln）。第二個(gè)EC群體（EC 2）表達(dá)參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的基因（Cd36，Fabp4，Lpl和Gpihbp1）和血管生成標(biāo)志物（Flt1）。EC 3群體表達(dá)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物Lyve1。

圖3.內(nèi)皮細(xì)胞（EC）分為3個(gè)不同的種群。

A，t-隨機(jī)鄰近嵌入（t-SNE）分析EC亞群。與所有其他主動(dòng)脈細(xì)胞相比，這3個(gè)EC亞群具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄譜。

B，小鼠主動(dòng)脈中所有VE-鈣黏著蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的t-SNE圖。重新標(biāo)識(shí)了3個(gè)亞群以及少量（5％）的細(xì)胞群體，這些群體是基于液滴的單細(xì)胞RNA測(cè)序的偽像。

C，多個(gè)基因顯示EC特異性表達(dá)，并在所有3個(gè)EC亞群中表達(dá)。 與所有其他細(xì)胞相比，在所有EC簇中表達(dá)的遺傳標(biāo)志物分為血管生成EC標(biāo)志物基因和粘附/轉(zhuǎn)運(yùn)EC標(biāo)志物基因。小提琴圖的y軸顯示了標(biāo)準(zhǔn)化的轉(zhuǎn)錄表達(dá)值。

每個(gè)亞群的特征是獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄因子譜（圖4B）。為了表征這些基于轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)對(duì)亞群身份的貢獻(xiàn)，使用TRRUST數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定了每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活的已知靶標(biāo)。EC2顯示Pparg激活基因的表達(dá)明顯更高（圖4C），與該亞群中Pparg和其他脂質(zhì)處理基因的更高表達(dá)一致。EC亞群中多種轉(zhuǎn)錄因子及其靶標(biāo)的差異表達(dá)表明其不同的功能特性。

圖4.內(nèi)皮細(xì)胞（EC）亞群的基因表達(dá)特征。

A，每個(gè)EC亞群具有特異性表達(dá)的前20個(gè)基因。點(diǎn)圖顯示了表達(dá)每個(gè)基因的細(xì)胞百分比（點(diǎn)大小）和表達(dá)水平（點(diǎn)顏色）。

B，EC亞群的轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)。

C，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-G）在EC 1和EC 2亞群中的表達(dá)。*** Mann–Whitney U檢驗(yàn)P <0.001。

為了系統(tǒng)地識(shí)別EC亞群的細(xì)胞功能，對(duì)細(xì)胞亞群的基因集富集表達(dá)譜進(jìn)行分析。利用注釋為與EC相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程基因集對(duì)其進(jìn)行區(qū)分，雖然可以明確將所有內(nèi)皮細(xì)胞亞群與其他主動(dòng)脈細(xì)胞區(qū)分開(kāi)，但不足以解決亞群之間的差異（圖5A）。進(jìn)一步在每個(gè)亞群的前50個(gè)標(biāo)志物進(jìn)行了途徑富集。EC1標(biāo)志物選擇性富集在細(xì)胞外基質(zhì)組織和整聯(lián)蛋白細(xì)胞表面相互作用途徑，而EC2標(biāo)志物選擇性富集在血漿脂蛋白組裝、重塑和清除途徑，2個(gè)EC亞群之間存在顯著差異（圖5B）。

同時(shí)利用血管生成基因集區(qū)分2個(gè)亞群，EC中血管生成的異質(zhì)性通常歸結(jié)為“尖端”細(xì)胞與“莖”細(xì)胞之間的區(qū)別，研究發(fā)現(xiàn)利用尖端細(xì)胞基因可以有效的區(qū)分EC，并在EC 2中表達(dá)水平增加。

4 西方飲食喂養(yǎng)小鼠的主動(dòng)脈中的scRNA測(cè)序揭示了內(nèi)皮亞群的保守和飲食依賴性標(biāo)志物

為了確定飲食對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞亞群標(biāo)志物的影響，本研究分析了飼喂正常和西方飲食的小鼠的主動(dòng)脈scRNA測(cè)序譜。基于PAC顯示了數(shù)據(jù)集之間的差異（圖6A），基于典型關(guān)聯(lián)分析突顯了兩個(gè)數(shù)據(jù)集之間的相似性（圖6B）。應(yīng)用于相似性對(duì)齊的數(shù)據(jù)集的聚類算法顯示了在正常主動(dòng)脈數(shù)據(jù)中所確定的3個(gè)主要的亞群（圖6C）。同樣的所有EC亞群均表達(dá)EC特異性標(biāo)志物，在兩種飲食條件下都將它們與其他主動(dòng)脈細(xì)胞類型區(qū)分開(kāi)。進(jìn)一步確定了所有EC亞群對(duì)西方飲食反應(yīng)的標(biāo)志物（圖6D），包括肌球蛋白輕鏈9（Myl9）、轉(zhuǎn)膠蛋白（Tagln）和Acta2在內(nèi)的收縮功能的基因表達(dá)均上調(diào)。

圖6 內(nèi)皮細(xì)胞（EC）亞群的保守標(biāo)志物和飲食依賴性標(biāo)志物。

A，基于主成分分析的t-SNE分析正常飲食和西方飲食EC單細(xì)胞RNA測(cè)序譜。

B，基于典型關(guān)聯(lián)分析的t-SNE分析正常飲食和西方飲食EC單細(xì)胞RNA測(cè)序譜。

C，在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中確定的EC的保守亞群。D，EC亞群的保守飲食獨(dú)立標(biāo)志物和飲食誘導(dǎo)的變化的泛亞群標(biāo)志物。與飲食無(wú)關(guān)的亞群標(biāo)志物與先前確定的標(biāo)志物相同，而西方飲食在所有EC亞群中均誘導(dǎo)了收縮蛋白Myl9、Tagln和Acta2。

5 用亞群衍生標(biāo)志物鑒定EC原位異質(zhì)性

選擇具有代表性的EC 1和EC 2標(biāo)志物物以原位鑒定EC亞群的空間位置。根據(jù)scRNA測(cè)序數(shù)據(jù)，Vcam1和Cd36分別是EC1和EC2的標(biāo)志物（圖7A）。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)原位成像證實(shí)了Vcam1+/Cd36?和Vcam1?/Cd36+的EC群體（圖7B）。主動(dòng)脈根部和胸降主動(dòng)脈的免疫熒光顯示了Vcam1和Cd36表達(dá)的不同區(qū)域。在3個(gè)主動(dòng)脈根部的樣本中，在較小曲率下Vcam1/Cd36的對(duì)數(shù)平均值顯著高于較大曲率（圖7C）。主動(dòng)脈根部較大曲率的ECs表現(xiàn)出低Vcam1表達(dá)和高Cd36表達(dá)，并具有細(xì)長(zhǎng)形態(tài)；主動(dòng)脈根部曲率較小的EC表現(xiàn)為長(zhǎng)方體形態(tài)，同時(shí)具有較高的Vcam1表達(dá)和較低的Cd36表達(dá)（圖7D、7E）。胸降主動(dòng)脈的近端部分還具有高Vcam1和低Cd36的區(qū)域（圖7F和7G）。

圖7 鑒定出的內(nèi)皮細(xì)胞（EC）亞群的組織學(xué)相關(guān)性。

A，Vcam1（EC 1相關(guān)標(biāo)志物）和Cd36（EC 2相關(guān)標(biāo)志物）的小提琴圖比較。

B，具有Vcam1+/Cd36-和Vcam1-Cd36+的小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)，顯示出對(duì)應(yīng)于亞群標(biāo)志物的異質(zhì)性。數(shù)字表示每個(gè)象限中的細(xì)胞比例。

C，在大（GC）和?。↙C）曲率的主動(dòng)脈根的Vcam1 / Cd36比率的對(duì)數(shù)值。*** Mann–Whitney U檢驗(yàn)P <0.001。

D，主動(dòng)脈根中Vcam1和Cd36的免疫熒光顯微圖像。

E，主動(dòng)脈根中Vcam1熒光強(qiáng)度和Cd36熒光強(qiáng)度。

F，降主動(dòng)脈中Vcam1和Cd36的免疫熒光顯微圖像。

G，降主動(dòng)脈中Vcam1熒光強(qiáng)度和Cd36熒光強(qiáng)度。

6 孟德?tīng)栔鲃?dòng)脈病變基因的表達(dá)鑒定相關(guān)細(xì)胞和生物學(xué)途徑

本研究應(yīng)用該主動(dòng)脈單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)確定不同細(xì)胞類型在主動(dòng)脈疾病發(fā)病機(jī)理中的作用。通過(guò)確定具有與疾病相關(guān)的已知編碼突變的30個(gè)基因的細(xì)胞特異性表達(dá)發(fā)現(xiàn)，其中多個(gè)基因在VSMC中表達(dá)量最高（圖8A）。影響肌肉收縮的基因（例如Myhlk、Myh11）主要在VSMC中表達(dá)。具有細(xì)胞外基質(zhì)功能的基因在成纖維細(xì)胞中表達(dá)量最高（例如Col5a2、Col5a1、Col3a1）。在VSMC、成纖維細(xì)胞和EC中，胸主動(dòng)脈瘤和解剖引起的突變會(huì)分為不同的細(xì)胞表達(dá)模式（圖8B）VSMC特異性基因：Myhlk、Myh11、Acta2和Flna；VSMC-成纖維細(xì)胞高但EC表達(dá)最少的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的基因：Col4a5、Col5a1、Col5a2、Fbn1、Mfap5和Col3a1；只在EC中表達(dá)的Notch1。包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β途徑基因（Tgfb2S、mad2、Smad3、Smad4、Tgfbr1）和2個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因（Lox、Ern）在三種細(xì)胞中均表達(dá)。

圖8.不同細(xì)胞類型的主動(dòng)脈病變基因的表達(dá)。

A，按細(xì)胞類型表達(dá)與孟德?tīng)栔鲃?dòng)脈病變相關(guān)的30個(gè)基因。大多數(shù)在血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）中具有最高的表達(dá)，一些在成纖維細(xì)胞（Fibro）中顯示最高表達(dá)。兩個(gè)基因（Mat2a和Notch1）在內(nèi)皮細(xì)胞（EC）中表達(dá)最高。

B，三元圖顯示了主動(dòng)脈病變基因在EC、VSMC和成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。幾個(gè)基因僅在VSMC中表達(dá)，而大多數(shù)基因則主要在VSMC和成纖維細(xì)胞中表達(dá)。具有收縮功能的基因呈綠色；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β反應(yīng)基因?yàn)榧t色；細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因?yàn)樗{(lán)色；未分配的基因?yàn)楹谏?/span>Macro表示巨噬細(xì)胞；Mono表示單核細(xì)胞。

本研究比較了兩種不同的酶解單細(xì)胞方案和序列深度，發(fā)現(xiàn)膠原酶和彈性蛋白酶的結(jié)果相似。但是，某些方法可能更適合于特定的細(xì)胞類型，例如彈性蛋白酶可以提高VSMC產(chǎn)量。而高深度和低深度測(cè)序的配置文件的比較表明可以相對(duì)較淺的測(cè)序識(shí)別血管組織中的細(xì)胞群。

本研究在主動(dòng)脈中鑒定了3個(gè)不同的EC亞群，EC異質(zhì)性在血管功能中發(fā)揮重要的作用，主動(dòng)脈中的scRNA測(cè)序可以識(shí)別在EC中動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的全套轉(zhuǎn)錄譜。3個(gè)EC亞群共享一些標(biāo)志物，但多個(gè)基因的表達(dá)不同，表明EC亞群在細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生、脂質(zhì)處理和血管生成或淋巴功能方面的功能具有區(qū)別。2個(gè)主要EC種群的空間分布進(jìn)一步證明，轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性可以識(shí)別功能不同的細(xì)胞亞群。在較小和較大的主動(dòng)脈曲率中觀察到EC 1（Vcam1）和EC 2（Cd36）的獨(dú)特分布模式，可能是血流和切應(yīng)力不同的結(jié)果。但不能確定這些亞群是僅由于環(huán)境暴露（例如剪切應(yīng)力）還是發(fā)育的結(jié)果，需要進(jìn)一步研究。此外，本研究對(duì)EC亞群如何應(yīng)對(duì)病理應(yīng)激源進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)暴露于西方飲食后EC的收縮基因表達(dá)上調(diào)。

最后本研究提出使用scRNA測(cè)序分析完整的血管環(huán)境可以為疾病發(fā)病機(jī)理提供重要見(jiàn)解。研究劃分了3種主要血管壁細(xì)胞類型對(duì)孟德?tīng)栔鲃?dòng)脈病變的相對(duì)貢獻(xiàn)，為進(jìn)一步了解遺傳性主動(dòng)脈瘤的基因型與表型的相關(guān)性提供基礎(chǔ)，并為這些疾病開(kāi)發(fā)針對(duì)性的療法提供指導(dǎo)方向。

事實(shí)證明，基于液滴的scRNA測(cè)序的轉(zhuǎn)錄譜分析是定義細(xì)胞身份的標(biāo)準(zhǔn)。在人類細(xì)胞圖譜協(xié)會(huì)的努力下，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法正在迅速發(fā)展，為深入研究包括血管細(xì)胞等各種生物學(xué)試驗(yàn)提供支持。

廣泛存在于人體所有器官中的血管和動(dòng)脈壁細(xì)胞易患多種疾病，對(duì)其單細(xì)胞異質(zhì)性的了解較少，scRNA技術(shù)使無(wú)偏向性的表征復(fù)雜的動(dòng)脈組織中的各種細(xì)胞成為可能。本研究使用最新的基于液滴的scRNA測(cè)序方法來(lái)表征來(lái)自整個(gè)鼠主動(dòng)脈的6200個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的基因和功能途徑，鑒定出形成該大動(dòng)脈主要細(xì)胞類型的10個(gè)細(xì)胞簇：成纖維細(xì)胞、VSMC、EC和免疫細(xì)胞群。還確定了小鼠主動(dòng)脈內(nèi)具有不同功能的EC的3個(gè)不同亞群。同時(shí)孟德?tīng)栔鲃?dòng)脈病變綜合征相關(guān)的基因在不同亞群中的分布可以說(shuō)明這些細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄譜的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究證明利用scRNA測(cè)序技術(shù)可以表征基因表達(dá)的異質(zhì)性，進(jìn)一步用于區(qū)分主要的細(xì)胞類型及具有不同功能的亞群，為深入研究各種血管疾病的發(fā)生機(jī)制提供了重要的方法借鑒。 

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