編譯：Yong-qin，編輯：十九、江舜堯。
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二代測序（SGS）廣泛用于發(fā)現(xiàn)藏紅花的新功能基因，如不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)了新的CCD類型基因，不同組織部位的轉(zhuǎn)錄本揭示了調(diào)控脫輔基類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子。但是二代測序?qū)ψx長的限制影響了轉(zhuǎn)錄本的完整性，而三代測序（TGS）/單分子測序（SMRT）可讀取全長mRNA序列，其中著名的PacBio測序平臺可一次讀取10Kb堿基。目前PacBio測序廣泛用于功能基因挖掘和可變剪接鑒定。
本研究采用PacBio測序?qū)Ρ?/span>藏紅花5個組織（球莖、葉片、花被片、雄蕊、柱頭）的全長轉(zhuǎn)錄組。由于目前缺少藏紅花的完整基因組，本研究將對藏紅花的進化地位，尤其是脫輔基類胡蘿卜素生物合成的進化，提供新穎的見解。
論文ID
原名：Full-length transcriptome sequencing provides insights into the evolution of apocarotenoid biosynthesis in Crocus sativus
譯名：全長轉(zhuǎn)錄組揭示藏紅花在脫輔基類胡蘿卜素合成途徑的進化
期刊：Computational and Structural Biotechnology Journal
IF：4.720
發(fā)表時間：2020.03
通訊作者：劉永勝
通訊作者單位：四川大學生命科學學院
DOI號：10.1016/j.csbj.2020.03.022
實驗設計
結(jié)果
1、全長轉(zhuǎn)錄組測序獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)
從開花期的藏紅花植物組織提取總RNA進行PacBio測序，共產(chǎn)生1133474條reads，其中596356（52.61%）為完整的轉(zhuǎn)錄本，質(zhì)控后剩余138773條高質(zhì)量reads（準確率>99%）。片段總長介于800 – 4000 bp，相比先前研究使用的二代測序（610-1047 bp），全長轉(zhuǎn)錄組分析更有優(yōu)勢。將所有轉(zhuǎn)錄本在GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對，比對率為93.9%。BUSCO質(zhì)量評價結(jié)果表明完整的轉(zhuǎn)錄本占核心的保守真核基因的73.06%（圖1A），覆蓋率較高。由于全基因組序列尚未破譯，高質(zhì)量的全長轉(zhuǎn)錄組有助于識別編碼區(qū)域并描述藏紅花的進化歷史。
結(jié)合同源預測及從頭預測，本研究發(fā)現(xiàn)31755個蛋白編碼基因（GC含量約48.66%），編碼序列平均長度918bp。其中30197個基因在二代測序中同樣獲得，而29422個基因獲得數(shù)據(jù)庫注釋（圖1B）。獲得注釋的基因中，1130個鑒定為轉(zhuǎn)錄因子，涵蓋64個基因家族，其中C3H家族基因最多，其次為bHLH、bZIP、MYB家族基因。先前研究表明含有鋅指基序的轉(zhuǎn)錄因子與脫輔基類胡蘿卜素的調(diào)控有關，本研究共鑒定了88個C3H和56個C2H2家族基因，占所有轉(zhuǎn)錄因子的13%。
此外本研究預測了非編碼RNA，包括821個rRNA、393個tRNA、38個snoRNA、15個snRNA和10個miRNA。將miRNA與編碼基因進行比對，共確定645個候選靶標，其中鋅指轉(zhuǎn)錄因子的靶標較多，說明這些miRNA可能與脫輔基類胡蘿卜素有潛在關系，而并不直接靶向生物合成基因。此外，本研究鑒定226616個SSR，主要為A/T重復，編碼基因中有3714個SSR，說明非編碼區(qū)的SSR更豐富（圖1C）。
2、全長轉(zhuǎn)錄組比較分析揭示全基因組復制事件
為了揭示物種進化過程中的全基因組復制事件，本研究將藏紅花的序列與11個代表性物種比較，包括獼猴桃（Actinidia chinensis）、鳳梨（Ananas comosus）、蘆筍（Asparagus officinalis）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、無油樟（Amborella trichopoda）、茶樹（Camellia sinensis）、胡蘿卜（Daucus carota）、野芭蕉（Musa acuminata）、水稻（Oryza sativa）、番茄（Solanum lycopersicum）、玉米（Zea mays），共獲得19131個同源基因家族，包括311825個基因，其中177574個基因（6486個家族）在所有物種共有，代表其核心性（圖2A）。此外，有9841個基因（48個家族）是藏紅花里特有的，表明其物種物種的獨特性（圖2A）。GO富集分析表明這些特有基因與'代謝途徑’和'催化活性’相關（圖2B），其中有些代謝途徑與藏紅花的主要次級代謝物有關（藏紅花素、藏紅花苦甙、藏花醛），而催化活性主要為氧化還原酶、水解酶、類胡蘿卜素加雙氧酶。
在開花植物中，基因家族的增加/縮減是物種分化和多樣性的驅(qū)動力。本研究表明基因家族在物種適應性進化的過程中發(fā)生明顯地變化，一些特有的基因促成了藏紅花特有的性狀和品質(zhì)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明了藏紅花的進化地位，在同源基因家族中保留了8357個家族，其中2843個家族獲得新基因拷貝（圖2C）。這些基因富集于'電子傳遞鏈’，包括磷酸烯醇丙酮酸激酶活性、電子傳遞、呼吸電子傳遞鏈。電子傳遞鏈的功能與天冬氨酸、抗壞血酸、茄紅素、類胡蘿卜素的代謝密切相關。因此，'電子傳遞鏈’基因的新拷貝可能有助于藏紅花的代謝能量供應，促進脫輔基類胡蘿卜素的合成。此外，富集域還有'含雄性不育蛋白功能域’的基因，這表明藏紅花不育三倍體的形成與自然選擇有關。從全長轉(zhuǎn)錄組中確定了15900個基因的復制事件，并通過同義替代率（Ks）預測事件發(fā)生時間（圖2D）。
3、藏紅花在脫輔基類胡蘿卜素合成途徑的進化
藏紅花的柱頭有較高的商業(yè)價值，包括三種主要次級代謝物：藏紅花素、藏紅花苦甙、藏花醛。為了深入了解其分子機制，本研究用比較轉(zhuǎn)錄組進行分析。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的酶編碼基因的注釋，發(fā)現(xiàn)了參與脫輔基類胡蘿卜素生物合成的功能基因，包括9個類胡蘿卜素生物合成基因（GPPS, GGPPS, PS, PDS, Z-ISO, ZDS, CrtISO, β-LYC, BCH），和4個類胡蘿卜素裂解的基因（CCD, UGT, ALDH, β-GS），這些基因在許多物種中保守存在，證明了脫輔基類胡蘿卜素的合成途徑的保守性。
然而，脫輔基類胡蘿卜素的含量在物種間相差巨大，藏紅花中大量存在。生化分析表明，藏紅花中通過7,8/7’,8’位裂解玉米黃素產(chǎn)生藏花醛和藏紅花苦甙（由CCD基因家族產(chǎn)物催化），多數(shù)物種在9,10/9’,10’位裂解（圖3A），證明了CCD基因家族的獨立演化性。在轉(zhuǎn)錄組中共預測了13個CCD家族基因，數(shù)量明顯比其他物種的基因組注釋多（圖3A）。選擇5個物種的38個CCD基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖3B），可分為4個聚類，其中有3個類在單子葉植物和雙子葉植物中共有，表明CCD基因的存在非常古老，但同時同一物種的基因趨于同一分支，這表明基因復制事件發(fā)生于物種分化之后，這些復制事件使它們在進化過程中表現(xiàn)特定的功能。在藏紅花中，裂解玉米黃素7,8/7’,8’位鍵的關鍵酶基因鑒定為CsCCD2，聚類于CCD1分支（圖3B），說明是由物種分化后復制形成的。
對藏紅花5個組織（球莖、葉片、花被片、雄蕊、柱頭）的基因表達譜分析表明，CsCCD2在所有組織內(nèi)表達，而在柱頭中水平顯著較高（圖3C）。這證明CCD基因在柱頭中的特異表達性。通過對柱頭組織和其他4個組織的基因表達進行兩兩比較，鑒定差異表達基因，基因數(shù)量從87至1366，可見不同組織的轉(zhuǎn)錄具有動態(tài)性。但藏紅花的脫輔基類胡蘿卜素的合成的時空轉(zhuǎn)錄調(diào)控有待進一步研究。
結(jié)論
在藏紅花的全基因組測序未完成的情況下，本研究提出高質(zhì)量的全長轉(zhuǎn)錄組測序，且顯著提高了編碼基因的序列完整和功能注釋。同時，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)解釋了藏紅花的進化歷史，尤其是主要次級代謝產(chǎn)物（脫輔基類胡蘿卜素）基因的進化，結(jié)果表明關鍵酶CCD2由藏紅花進化產(chǎn)生。研究結(jié)果有助于進一步研究藏紅花基因和作物改良。
藏紅花中含有大量藏紅花素、藏紅花苦甙、藏花醛，是重要的經(jīng)濟作物。本研究用PacBio全長測序技術(shù)獲得三倍體藏紅花全長轉(zhuǎn)錄組。結(jié)果表明全基因組復制事件使得藏紅花中脫輔基類胡蘿卜素的積累，且藏紅花獲得了由CCD家族進化而來的基因CCD2，且表達水平極高，這揭示了藏紅花在脫輔基類胡蘿卜素合成途徑的進化。
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