摘要 二硫鍵是一種與多肽及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的化學(xué)鍵.當(dāng)多肽中存在多個(gè)半胱氨酸時(shí)，形成的二硫鍵可能會(huì)存在多種配對(duì)方式.快速且精準(zhǔn)地定位多肽中多對(duì)二硫鍵對(duì)研究多肽的結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系十分重要.本文開(kāi)發(fā)了一種基于化學(xué)裂解和生物質(zhì)譜的新方法，對(duì)利那洛肽中3對(duì)二硫鍵進(jìn)行了精準(zhǔn)定位.通過(guò)解析裂解后特異肽段的二級(jí)質(zhì)譜圖，確定利那洛肽中3對(duì)二硫鍵的配對(duì)方式分別為Cysl-Cys6,Cys2-Cys10和Cys5-Cys13.該方法為二硫鍵的定位研究提供了新思路.
關(guān)鍵詞 二硫鍵定位；化學(xué)裂解；生物質(zhì)譜；利那洛肽
二硫鍵(Disulfide bond)是多肽和蛋白質(zhì)中一種常見(jiàn)的翻譯后修飾，它是氨基酸序列中2個(gè)半胱氨酸(Cysteine)殘基的巰基基團(tuán)(—SH)發(fā)生氧化反應(yīng)失去2個(gè)氫(H)形成的共價(jià)鍵(—S—S一).二硫鍵并不是非常穩(wěn)定，氧化形成的二硫鍵也可以被還原形成游離的巰基，所以通常二硫鍵是動(dòng)態(tài)變化的化學(xué)鍵[1].二硫鍵廣泛存在于多肽和蛋白質(zhì)中，并不局限于蛋白質(zhì)的大小、功能和類(lèi)型.對(duì)于小于50個(gè)氨基酸的多肽，可能含有少量的二硫鍵；而對(duì)于一些大的蛋白質(zhì)，可能含有成百上千個(gè)二硫鍵[2].蛋白質(zhì)和多肽中的二硫鍵對(duì)其熱力學(xué)、力學(xué)和化學(xué)穩(wěn)定性至關(guān)重要，同時(shí)也參與對(duì)蛋白酶的抗性和活性的調(diào)節(jié)[3].精準(zhǔn)、快速地定位蛋白質(zhì)和多肽中二硫鍵配對(duì)方式是研究其結(jié)構(gòu)與功能的重要內(nèi)容之一.
早期定位二硫鍵的主要方法分為非片段法和片段法[4].非片段法包括X射線(xiàn)衍射晶體結(jié)構(gòu)解析法和多維核磁共振波譜法等，它們可以提供分子水平上的二硫鍵信息[3],其最大的優(yōu)勢(shì)為檢測(cè)方式非破壞性，可以實(shí)現(xiàn)樣品的重復(fù)利用[5];非片段法檢測(cè)時(shí)需要的樣品量較大且純度要求較高，由于該方法提供的結(jié)構(gòu)信息有限，所以不作為二硫鍵定位的典型方法.片段法包括對(duì)角線(xiàn)法、二硫鍵異構(gòu)及突變分析法、酶解法、化學(xué)裂解法、部分還原測(cè)序法和氰化半胱氨酸裂解法等[3].酶解法的應(yīng)用種類(lèi)繁多，包括2種酶交叉酶切[6]、復(fù)合酶切[71及3種酶交叉組合[8]等方式，可實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白或多肽碎裂的目的.但是酶解法也有一定的局限性，多數(shù)酶解的實(shí)驗(yàn)條件偏堿性，會(huì)增加二硫鍵交換幾率，且一些蛋白質(zhì)可能抗酶解或含有鄰位Cys,因而不適用于酶解法.從虎紋捕鳥(niǎo)蛛粗毒中分離得到的多種虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素就屬于不適合酶解法的多肽，采用部分還原和分步序列測(cè)定法可有效解決此問(wèn)題[9,10],但是該方法的缺點(diǎn)是步驟多、會(huì)產(chǎn)生中間產(chǎn)物且工作量大.此外，酶切質(zhì)譜法聯(lián)合氰基化裂解法也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)臨位Cys的二硫鍵的定位研究[11].
隨著生物質(zhì)譜的發(fā)展，基質(zhì)輔助激光解吸離子源[12,13]和電噴霧離子源[4-~16]質(zhì)譜逐漸應(yīng)用到二硫鍵的定位研究中.先將完整的蛋白質(zhì)或多肽酶解成含有不同定位信息的肽段，用質(zhì)譜檢測(cè)各個(gè)肽段的具體信息后，通過(guò)專(zhuān)業(yè)的二硫鍵特異性搜索軟件實(shí)現(xiàn)對(duì)二硫鍵配對(duì)方式的表征.復(fù)合酶切法和化學(xué)修飾法結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜得到了較好的應(yīng)用[17].
上述方法都屬于Bottom-up法，而傳統(tǒng)的Top-down法不適用于二硫鍵的定位研究，主要原因是二硫鍵封閉區(qū)域的碎片化不充分，碎片提供的結(jié)構(gòu)信息不足.新的電子轉(zhuǎn)移/高能碰撞解離技術(shù)可以提高碎片化效率，使得Top-down法應(yīng)用于二硫鍵定位研究成為可能.該方法減少了對(duì)多肽或蛋白的前期處理，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，能更直觀(guān)地表征二硫鍵的鏈接方式[18].但是，該方法的缺點(diǎn)是僅限于多肽內(nèi)單個(gè)二硫鍵，對(duì)于多對(duì)二硫鍵的定位效果不佳.\n利那洛肽是首個(gè)治療便秘的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶C激動(dòng)劑[19,20],它是由14個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽，其序列為H-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH,其中含有6個(gè)Cys,可形成3對(duì)二硫鍵，在如此短的序列中可能存在的配對(duì)方式有15種.在人工合成的過(guò)程中很重要的一個(gè)環(huán)節(jié)就是高效、快速、準(zhǔn)確地完成二硫鍵的正確配對(duì)，同時(shí)避免生成副產(chǎn)物影響其結(jié)構(gòu)和功能[21-23].為了開(kāi)發(fā)一種快速且精準(zhǔn)地定位多對(duì)二硫鍵的方法，本文以利那洛肽作為研究樣本，發(fā)展了一種基于化學(xué)裂解和生物質(zhì)譜的新方法.首先，在酸性條件下用三(2-羧乙基)膦(TCEP)對(duì)利那洛肽部分還原，用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(CDAP)進(jìn)行氰基衍生化反應(yīng)；隨后，在堿性條件下進(jìn)行化學(xué)裂解；最后，對(duì)碎裂肽段進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，所得譜圖結(jié)果經(jīng)人工分析明確多肽二硫鍵的配對(duì)方式.
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程
1.1.1 分子量檢測(cè)樣品的制備 稱(chēng)量0.1mg利那洛肽固體溶解于150μL水中；取30μL利那洛肽溶液加入10 μL DTT溶液(50 mmol/L DTT+50 mmol/L NH?HCO?),以850 r/min轉(zhuǎn)速于57 ℃振蕩孵育30 min,得到分子量檢測(cè)樣品.
1.1.2部分還原和化學(xué)裂解 實(shí)驗(yàn)用樣品的制備分為4步反應(yīng)(見(jiàn)Scheme1).稱(chēng)量0.14 mg利那洛肽固體溶解于50μL水中，加入1.93mg檸檬酸和57.32mg鹽酸胍，稀釋為終體積100μL的pH=3.0溶液.加入4μLTCEP溶液(0.1 mol/LTCEP+0.1 mol/L檸檬酸，pH=3.0),于25℃恒溫靜置反應(yīng)10 min.然后，加入80μLCDAP溶液(0.1 mol/LCDAP+0.1mol/L檸檬酸，pH=3.0),于25℃恒溫靜置反應(yīng)15min后，立刻用C?g脫鹽柱脫鹽并冷凍干燥，備用.\n化學(xué)裂解反應(yīng)在1mol/LNH?·H?O溶液中進(jìn)行.取20 μL鹽酸胍溶液(6 mol/L鹽酸胍+1mol/LNH?·H?O)復(fù)溶制備的凍干樣品，加入50μL1mol/LNH?·H?O溶液，于25℃恒溫靜置反應(yīng)1h.反應(yīng)結(jié)束后，立即將樣品冷凍抽干.最后，加入50 μLTCEP溶液(0.1 mol/L)復(fù)溶凍干的樣品，于37 ℃恒溫靜置反應(yīng)30 min.
1.1.3 MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè) 選擇10mg/mL CCA溶液作為基質(zhì)，分別將還原前、后的利那洛肽溶液\n與基質(zhì)混合并取0.75μL點(diǎn)在靶板上，自然干燥后，采用串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，激光源為335nm波長(zhǎng)的Nd:YAG激光器，加速電壓為20kV,分別采用正離子模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù).質(zhì)譜儀先用Myoglobin酶解肽段進(jìn)行外標(biāo)校正.樣品反射模式質(zhì)量掃描范圍為800~3000.對(duì)實(shí)驗(yàn)得到的譜圖采用Data Explorer軟件進(jìn)行處理和分析.
1.1.4 Q-Exactive液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè) 將待測(cè)樣品用流動(dòng)相A稀釋至10 pmol/μL.液相系統(tǒng)色譜柱為PepMap Cg(75μm×25cm),柱溫為45 ℃.流動(dòng)相A為水相(含0.1%FA),流動(dòng)相B為有機(jī)相\nACN溶液(含0.1%FA);色譜流速為300nL/min;洗脫梯度為0~55 min95%~70%A,5%~30%B;上樣量為2μL.質(zhì)譜掃描方式為正離子模式，數(shù)據(jù)采集方式為數(shù)據(jù)依賴(lài)模式，在一級(jí)全掃描和二級(jí)碎片離子掃描間進(jìn)行自動(dòng)切換.一級(jí)掃描使用Orbitrap軌道離子阱，掃描范圍為m/z200~2000,分辨率為70000.隨后進(jìn)行二級(jí)掃描，自動(dòng)選擇一級(jí)強(qiáng)度前10位的母離子進(jìn)行碎裂并用Orbitrap進(jìn)行掃描，碎裂方式為高能碰撞解離，掃描起始范圍為m/z110,分辨率為17500,掃描采用動(dòng)態(tài)排除模式，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為30 s.最后，用Xcalibur Qual Browser打開(kāi)質(zhì)譜產(chǎn)生的原始RAW文件，按照肽段的理論碎裂方式人工查找目標(biāo)離子的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖.
2 結(jié)果與討論
采用MALDI-TOF/TOF MS測(cè)定了還原前后利那洛肽的分子量.圖1(A)為還原前利那洛肽的一級(jí)質(zhì)譜圖，m/z1526.3274,1548.3103和1564.2809處的峰分別為利那洛肽的[M+H]*峰、[M+Na]*峰和[M+K]*峰.根據(jù)利那洛肽的理論氨基酸序列計(jì)算得到理論[M+H]*峰值為1532.4447,由此說(shuō)明實(shí)測(cè)樣品的單同位素分子離子峰比理論序列單同位素分子離子峰少6Da,推測(cè)該多肽樣品中可能含有由6個(gè)Cys組成的3對(duì)二硫鍵.圖1(B)為經(jīng)DTT還原后利那洛肽的一級(jí)質(zhì)譜圖，m/z 1532.4758,1554.4402和1570.4138處的峰分別為DTT還原后利那洛肽的[M+H]*峰、[M+Na]*峰和[M+K]*峰，與根據(jù)利那洛肽的理論序列計(jì)算得到的[M+H]*峰值(1532.4447)相同，進(jìn)一步佐證了這3對(duì)二硫鍵的存在.此外，利那洛肽含有大量Cys,可能在合成的過(guò)程中形成分子間二硫鍵.MALDI-TOF質(zhì)譜檢測(cè)僅得到利那洛肽的[M+H]*峰、[M+Na]*峰和[M+K]*峰[圖1(A)],在譜圖中相應(yīng)的位置未發(fā)現(xiàn)由分子間二硫鍵形成的二聚體峰.由此證明，研究中采用的利那洛肽不存在分子間二硫鍵.
在確認(rèn)利那洛肽存在3對(duì)二硫鍵后，采用部分還原、化學(xué)裂解結(jié)合生物質(zhì)譜的方法對(duì)二硫鍵進(jìn)行了定位研究.多肽在酸性條件下加入還原劑TCEP會(huì)發(fā)生部分還原反應(yīng)，形成僅有1對(duì)二硫鍵被還原的3種結(jié)構(gòu)形式.在加入CDAP進(jìn)行衍生化反應(yīng)后，S原子連上1個(gè)氰基生成—SCN,在堿性條件下裂解.然后，在部分還原條件下，連有氰基的Cys左側(cè)斷裂形成新的肽段片段，末端的Cys形成新的五元環(huán)[24,25].最后，利用質(zhì)譜分析這些新的肽段片段，從而對(duì)多肽中二硫鍵進(jìn)行定位.對(duì)于含有3對(duì)二硫鍵的利那洛肽，經(jīng)過(guò)部分還原、氰基化和堿性條件下化學(xué)裂解反應(yīng)后，理論上共計(jì)可以產(chǎn)生8個(gè)片段離子，不同配對(duì)方式所產(chǎn)生8個(gè)片段離子的組合方式不同.
首先，對(duì)部分還原后化學(xué)裂解樣品的一級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行分析，找到肽段片段的母離子峰，根據(jù)母離子的組合方式推測(cè)出潛在的二硫鍵配對(duì)方式.然后，對(duì)這些片段離子進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，確認(rèn)這些片段離子對(duì)應(yīng)的氨基酸序列.
在一級(jí)質(zhì)譜譜圖中檢測(cè)到2個(gè)離子峰([M+H]*):m/z644.1625和956.3060,可能是部分還原狀態(tài)下二硫鍵Cys1-Cys6被打開(kāi)而形成的2個(gè)化學(xué)裂解片段峰.對(duì)這2個(gè)片段峰進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析得到的序列分析圖如圖2所示(圖中藍(lán)色代表b離子，紅色代表y離子，綠色代表b-H,O離子).圖2(A)為片段峰m/z644.1625的串聯(lián)質(zhì)譜序列分析圖，檢測(cè)到3個(gè)b離子和1個(gè)b-H,O離子，分別為b1(m/z\n232.02),b2(m/z361.06),b3(m/z524.13)和b2-H,O(m/z343.05).這些完整的b系列離子驗(yàn)證了片\n段峰m/z644.1625對(duì)應(yīng)氨基酸序列為Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys.圖2(B)為片段m/z956.3060的串聯(lián)質(zhì)譜序列分析圖，檢測(cè)到4個(gè)b離子、3個(gè)y離子和2個(gè)b-H?O離子，分別是b1(m/z243.05),b2(m/z\n340.11),b3(m/z411.14),b4(m/z514.16),y1(m/z 182.08),y2(m/z 285.09),y7(m/z714.26)和b5-H?O(m/z597.19),b6-H?O(m/z653.53).這些完整的b系列離子和部分y系列離子驗(yàn)證了片段m/z956.3060對(duì)應(yīng)氨基酸序列為Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr.
離子峰([M+H]*)m/z926.2957和571.0655可能是部分還原狀態(tài)下二硫鍵Cys2-Cys10被打開(kāi)而形成的2個(gè)化學(xué)裂解片段峰.除這2個(gè)片段峰外，理論片段峰值為121.0436,分子量偏小，在質(zhì)譜中未檢測(cè)到.對(duì)這2個(gè)片段峰進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析得到的序列分析圖如圖3所示.圖3(A)是片段峰m/z926.2957的串聯(lián)質(zhì)譜序列分析圖，檢測(cè)到4個(gè)b離子，1個(gè)y離子和1個(gè)b-H?O離子，分別是b1(m/z 258.05),b2(m/z 421.12),b3(m/z 524.13),b5(m/z 741.18),y2(m/z 186.12)和b4-H?O(m/z609.13),這些完整的b系列離子驗(yàn)證了片段峰m/z926.2957對(duì)應(yīng)氨基酸序列為Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala.圖3(B)為片段峰m/z571.0655的串聯(lián)質(zhì)譜序列分析圖，檢測(cè)到2個(gè)b離子和1個(gè)分子離子峰，它們分別是b2(m/z287.00),b4(m/z553.06)和[M+H]*(m/z571.07),表明片段峰\nm/z571.0655對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr.
離子峰([M+H]*)m/z516.1966,792.2581和310.0853可能是部分還原狀態(tài)下二硫鍵Cys5-Cys13被打開(kāi)而形成的3個(gè)化學(xué)裂解片段峰.片段峰m/z516.1966和310.0853只在一級(jí)質(zhì)譜中被檢測(cè)到，由于離子化效率低導(dǎo)致串聯(lián)質(zhì)譜碎裂效果較差，這2個(gè)片段峰的一級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4.圖5為片段峰\nm/z792.2581的串聯(lián)質(zhì)譜序列分析圖，檢測(cè)到4個(gè)b離子，分別是b1(m/z232.02),b2(m/z346.06),\nb3(m/z443.12)和b4(m/z514.16).這些完整的b系列離子驗(yàn)證了片段峰m/z792.2581對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly.
實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)裂解結(jié)合生物質(zhì)譜的方法對(duì)利那洛肽部分還原后化學(xué)裂解產(chǎn)生的片段離子進(jìn)行了質(zhì)\n譜分析，結(jié)果見(jiàn)表1.檢測(cè)到的m/z644.1625和956.3060離子峰對(duì)應(yīng)二硫鍵Cys1-Cys6被打開(kāi)而形成的化學(xué)裂解片段峰；m/z926.2957和571.0655離子峰對(duì)應(yīng)二硫鍵Cys2-Cys10被打開(kāi)而形成的化學(xué)裂解片段峰；m/z516.1966,792.2581和310.08533個(gè)離子峰對(duì)應(yīng)二硫鍵Cys5-Cys13被打開(kāi)而形成的化學(xué)裂解片段峰.以上結(jié)果表明，利那洛肽的3對(duì)二硫鍵的配對(duì)方式為Cys1-Cys6,Cys2-Cys10和Cys5-Cys13.
Table 1 Fragment ion mass spectrometry results of Linaclotide Acetate
本文以利那洛肽為例，實(shí)現(xiàn)了分子內(nèi)3對(duì)二硫鍵的精準(zhǔn)定位分析.對(duì)于1個(gè)多肽內(nèi)嵌套更多層的分子內(nèi)二硫鍵和分子間二硫鍵，從理論上本文方法仍是有效的.本文對(duì)于二硫鍵定位方法的核心步驟是在酸性條件下采用還原劑TCEP進(jìn)行部分還原反應(yīng)，形成只含有1對(duì)二硫鍵被還原的3種結(jié)構(gòu)形式.通過(guò)對(duì)被還原的二硫鍵進(jìn)行化學(xué)裂解反應(yīng)，找到對(duì)應(yīng)的特征肽段片段，證明該二硫鍵的配對(duì)方式.因此，對(duì)于多肽內(nèi)嵌套更多層的分子內(nèi)二硫鍵和分子間二硫鍵，通過(guò)控制部分還原反應(yīng)的條件，只要形成1對(duì)二硫鍵被還原的結(jié)構(gòu)形式都可以使用本文方法進(jìn)行二硫鍵定位.其次，本文方法對(duì)于多對(duì)二硫鍵進(jìn)行定位方法需要的初始樣品量在微克級(jí)別，只要通過(guò)3步反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)結(jié)合生物質(zhì)譜對(duì)二硫鍵的精準(zhǔn)定位.相比于常規(guī)的多種酶解法反應(yīng)條件的限制，部分還原和分步序列測(cè)定法需要消耗大量的時(shí)間進(jìn)行色譜分離，本方法則具有樣品需求量少、簡(jiǎn)單快速和定位精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn).
3 結(jié) 論
構(gòu)建了一種部分還原、化學(xué)裂解結(jié)合生物質(zhì)譜的新方法，對(duì)利那洛肽中3對(duì)二硫鍵配對(duì)方式進(jìn)行了精準(zhǔn)定位.通過(guò)還原前后利那洛肽分子量與氨基酸序列理論分子量的對(duì)比，揭示其存在3對(duì)二硫鍵；通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜分析解析了化學(xué)裂解后片段的序列信息及對(duì)應(yīng)的二硫鍵配對(duì)信息.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利那洛肽的3對(duì)二硫鍵配對(duì)方式為Cys1-Cys6,Cys2-Cys10和Cys5-Cys13.該方法具有樣品需求量少、耗時(shí)短、步驟簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)、重現(xiàn)性好及適用范圍廣等特點(diǎn)，為多肽二硫鍵的配對(duì)定位分析提供了新思路.
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