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原名：Microbiome-derived carnitine mimics as previously unknown mediators of gut-brain axis communication

譯名：微生物組衍生的肉毒堿模擬物是此前未知的腸-腦軸溝通介質(zhì)

期刊：Science Advances

IF:12.80

發(fā)表時間：2020.03.11

通訊作者：Daniel M Wall

通訊作者單位：格拉斯哥大學(xué)

1. 質(zhì)譜成像（MSI）發(fā)現(xiàn)來自GF和SPF小鼠體內(nèi)差異代謝物

為了鑒定介導(dǎo)菌群-腸-腦軸（MGB）軸交流的未知菌群代謝產(chǎn)物，我們使用了質(zhì)譜成像（MSI）來鑒定無特定病原體（SPF）C57BL小鼠和無菌小鼠（GF）C57BL之間腸道和大腦中都存在的差異的菌群代謝物。我們通過基質(zhì)輔助激光解吸電離法(MALDI)-MSI和解吸電噴霧電離法(DESI)-MSI檢測小鼠腸道和大腦中質(zhì)荷比（m / z）為160.133的代謝物分子，發(fā)現(xiàn)SPF小鼠的代謝物濃度水平比GF小鼠高20倍（圖1和圖S1）。MALDI-MSI用于獲取腦區(qū)域分析的高橫向分辨率圖像，而DESI-MSI用于進一步的高光譜分辨率分析。在GF小鼠中檢測發(fā)現(xiàn)其代謝物水平與組織陰性對照的基線相當(dāng)（圖S1）。該代謝物分子臨時稱為Met1，在大腦的白質(zhì)區(qū)域（髓質(zhì)，胼胝體和小腦活樹）特別豐富（圖1B）。

圖1 來自C57BL / 6 GF和SPF小鼠的腦和腸切片上的MALDI-MSI（A）腦組織的蘇木精和曙紅染色切片（上）和MALDI-MSI圖像（下），MALDI-MSI技術(shù)顯示在m / z 160.133處發(fā)現(xiàn)了一個峰，該峰在GF小鼠中不存在，但存在于SPF小鼠腦中的離散位置；（B）SPF大腦不同區(qū)域中m / z 160.1的相對豐度的條形圖，以及整個大腦的平均值；（C）該代謝產(chǎn)物也存在于SPF結(jié)腸中，但在GF結(jié)腸中不存在。注釋：Cb，小腦；arb，小腦活樹；MO，延髓；P，腦橋；MB，中腦；cc，胼胝體；fr，束狀反射。

2.差異代謝物來源于體內(nèi)的腸道菌

由于在GF小鼠中檢測到的代謝物Met1水平與陰性對照相當(dāng)，因此表明該化合物在SPF小鼠中的來源于腸道菌群微生物。因此，我們確定了用不可吸收的抗生素混合物（ABX）治療7天是否可以減少結(jié)腸中的Met1。觀察到該處理可顯著降低Met1水平（P≤0.05），確認Met1是由腸道微生物代謝產(chǎn)生（圖S3）。接下來，我們從C57BL / 6小鼠的腸道菌群中篩選出能夠產(chǎn)生Met1的腸道菌群菌株。從鼠糞中分離出的細菌菌株在厭氧菌肉湯（FAB）瓊脂平板上生長，然后將菌落重懸于磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中，并點到載玻片上，通過MSI篩選Met1。通過16S rDNA測序確定梭狀芽孢桿菌和共生梭狀芽孢桿菌 (Clostridium clostridioforme and Clostridium symbiosum)（圖2）。兩種菌株都是形成腸孢子的人類腸道共生體，它們都屬于厭氧菌，而梭狀梭狀芽胞桿菌也是條件致病菌。

圖2. DESI-MSI用于篩選腸道細菌產(chǎn)生目標(biāo)代謝產(chǎn)物。測試的細菌菌株： (A) C. symbiosum LM19R, (B) C. symbiosum LM19B, (C) C. clostridioforme LM41A, (D) C. symbiosum LM42D, (E) Bifidobacterium animalis LM33, (F) Lactobacillus animalis LM31, (G) Propionibacterium spp. YM23, (H) Clostridium difficile LM27, (I) Enterococcus faecalis YM13, (J) Bacteroides fragilis NCTC 9343 (type strain), (K) C. clostridioforme NCTC 11224 (type strain), (L) C. clostridioforme NCTC 7155 (type strain), (M) blank control, (N) blank control, (O) C. symbiosum LM19R, and (P) Escherichia coli F18.

 圖S3 用抗生素治療7天的小鼠結(jié)腸切片的MALDI-MSI表明，與對照組相比，用抗生素治療的小鼠結(jié)腸中m/z 160.1的代謝產(chǎn)物減少。（a）肉毒堿圖像（m / z 162.1）顯示為對照，以證明在抗生素治療的小鼠中代謝產(chǎn)物并未普遍減少；（b） 與對照相比，經(jīng)抗生素處理的小鼠結(jié)腸中m/z 160.1離子強度（通過TIC標(biāo)準(zhǔn)化）的箱形圖；（c）在一周的ABX處理小鼠糞便上進行腸道微生物組的16S rRNA基因測序和分析，并與未處理的對照組進行比較，ABX和無ABX樣品之間16s rRNA基因序列分析；（d）16S rRNA基因測序的未加權(quán)UniFrac的PCoA分析；（e）描繪在經(jīng)過和未經(jīng)過ABX處理的腸道微生物組中門的相對豐度的分類圖。  ABX處理導(dǎo)致少數(shù)更占優(yōu)勢的操作分類單位（OTU）減少，從而可以建立獨特的OTU，從而增加其在菌群中的比例。

3.對菌群產(chǎn)生的差異代謝物進行結(jié)構(gòu)確定

在此測試的其他梭菌菌株均未產(chǎn)生該分子，并且在所有測試的梭狀梭菌菌株中均未檢測到其產(chǎn)生，包括梭狀梭菌型菌株NCTC11224（圖2）。為了確保細菌代謝物是Met1而不是結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，我們對梭狀梭狀芽孢桿菌的m / z 160.133和鼠腦的Met1進行了串聯(lián)質(zhì)譜分析（MS/MS）。來自不同來源的Met1產(chǎn)物離子質(zhì)譜匹配，證實來自鼠腦和梭狀梭菌的分子在結(jié)構(gòu)上相同（圖S4）。根據(jù)獲得的MS /MS質(zhì)譜，我們得出結(jié)論，Met1在結(jié)構(gòu)上與肉堿類似，因為觀察到兩個指示的三甲胺基團質(zhì)量碎片（m /z 58.066和m/z 60.081）以及質(zhì)量差。羧酸基團（m / z 101.060和m / z 55.055的產(chǎn)物離子之差）。此外，生成的MS / MS譜圖看起來與先前報道的5-氨基戊酸甜菜堿（5-AVAB；也稱為N-三甲基-5-氨基戊酸）具有相似的m / z 160.133。但是，在MS / MS碎裂過程中，我們注意到在Met1與合成的5-AVAB標(biāo)準(zhǔn)品之間具有更高的碰撞能量時，m / z 60.081和m / z 55.055處的峰強度存在明顯差異，這使我們懷疑Met1為5-AVAB（圖S5）。為了明確闡明其結(jié)構(gòu)，我們對包含Met1的細菌進行了核磁共振（NMR）相關(guān)光譜法（¹H-¹H COSY）。NMR確定Met1是僅在甲基側(cè)鏈位置不同的兩個結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的混合物，位于C3 [3-甲基-4-(三甲基銨)丁酸(3M-4-TMAB)]或C4 [4-(三甲基銨)戊酸酯(4-TMAP)]的結(jié)構(gòu)（圖3）。NMR分析還顯示，細菌與同族分子γ-丁甜菜堿（GBB）并以等摩爾比產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。在梭狀梭菌中檢測到GBB以及3M-4-TMAB和4-TMAP，表明它可能是這些分子的前體，也是肉堿的直接前體。然而，與3M-4-TMAB和4-TMAP不同的是，GBB是由一系列腸道細菌和哺乳動物細胞合成的，這意味著追蹤3M-4-TMAB和4-TMAP的細菌合成產(chǎn)生的GBB是不可能的。

圖3.粗提液的¹H-¹H COZY顯示了三種相關(guān)的三甲基銨衍生物的出現(xiàn)。交叉峰已進行了相應(yīng)的彩色標(biāo)記，而光譜上顯示的線表示相應(yīng)衍生物：3M-4-TMAB（綠色）和4-TMAP（紅色）以及去甲基化同源物GBB（黑色）中相鄰偶聯(lián)質(zhì)子之間的相關(guān)性。

 圖S4 對大腦中發(fā)現(xiàn)的代謝物和梭狀梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生的相同m / z（160.133）的代謝物進行了MS / MS分析。在一定范圍的HCD產(chǎn)生的相應(yīng)的較小產(chǎn)物離子表明代謝物相同。m / z 60.081和58.066的峰表明存在三甲胺基團。m / z 101.060和55.055之間的產(chǎn)物離子之間的差異表明羧基的損失，也與猜測的結(jié)構(gòu)一致。

 圖S5 來自MS / MS分析的合成標(biāo)準(zhǔn)5-AVAB質(zhì)譜與大腦中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜圖m / z為160.133。MS / MS分析是在各種能量HCD15、25、35、50、65、75和100下進行的。在較低的碰撞能量（HCD15-35）下，顯示了一個完整的光譜，m / z 50-180，但是在較高的碰撞能量（HCD50-100）下，該質(zhì)譜被縮放以顯示一個m / z 50-120的范圍。在HCD 65和75處，在55.055處出現(xiàn)了明顯的峰差異，與來自大腦的m / z 160.133相比，在5-AVAB中明顯更低。

4.差異代謝物與肉堿的空間共定位

因為3M-4-TMAB在結(jié)構(gòu)上與肉堿高度相似，而4-TMAP與肉堿的直接前體GBB相似，所以我們使用MSI來檢查3M-4-TMAB和4-TMAP與肉堿在SPF小鼠腦中的共定位。肉堿是脂肪酸氧化（FAO）的重要介質(zhì)，它以酰基肉堿的形式將長鏈脂肪酸穿過膜穿入線粒體，并在那里被分解。使用MALDI-MSI進行肉堿的可視化，并使用DESI-MSI獲得準(zhǔn)確的m / z（162.112）以進行后續(xù)鑒定（圖4）。來自MALDI-MSI和DESI-MSI的m / z 160.1和m / z 162.1的質(zhì)譜圖如圖2所示。使用SpectralAnalysis對3M-4-TMAB / 4-TMAP和肉堿的MSI圖像進行處理。計算了m / z 160.1（3M-4-TMAB和4-TMAP）和m / z 162.1（肉堿）的高強度區(qū)域的重疊，并確定了每個分子在三個截面上的這些分子的Pearson相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，信號與大腦中3M-4-TMAB和4-TMAP與肉堿之間的空間共定位（Pearson相關(guān)性：SPF1，0.921547; SPF2，0.906855; SPF3，0.609946）之間存在明顯的重疊，以及許多其他分子皮爾遜相關(guān)系數(shù)超過0.8（圖4）。還確定了GF小鼠大腦中m / z 160.1和m / z 162.1的Pearson相關(guān)系數(shù)，發(fā)現(xiàn)它們的存在不相關(guān)（Pearson相關(guān)：GF1，-0.12976； GF2，-0.00027； GF3，0.177441）。這進一步表明，在GF小鼠腦中檢測到的m / z 160.1信號可能是由質(zhì)量相似的分子（如圖S1B中所述）導(dǎo)致的，而在本研究中無法解決。為了確保SPF小鼠中的分子共定位是相關(guān)性的基礎(chǔ)，而不是基于組織的離子抑制變化，在分析之前還應(yīng)用了總離子歸一化。這表明在m / z 162處的肉堿是與3M-4-TMAB / 4-TMAP相關(guān)的前3個高度相關(guān)的分子。因此，除了在結(jié)構(gòu)上與肉堿及其前體相似外，還在大腦內(nèi)的相同位置發(fā)現(xiàn)了3M-4-TMAB和4-TMAP。 

圖4. MALDI-MSI轉(zhuǎn)換為二進制圖像，顯示了m / z 160.1(3M-4TMAB / 4-TMAP)和m / z 162.1（肉堿）離子圖像的高強度（黑色）和低強度（灰色）區(qū)域。然后，將這些區(qū)域的重疊計算為m / z 160.1圖像的高強度區(qū)域中像素的百分比，該像素在m / z 162.1圖像中也是高強度的。此外，針對三個生物重復(fù)樣本（SPF1，SPF2和SPF3）中的每個組織，計算了兩個圖像之間的Pearson相關(guān)系數(shù)，系數(shù)1表示完全共定位，而-1表示沒有共定位（SPF1重疊92.85714，Pearson相關(guān)系數(shù)0.921547；SPF2 93.20652、0.906855；SPF3 63.20542、0.609946）。

5. 3M-4-TMAB和4-TMAP代謝物在GF小鼠腦內(nèi)的濃度水平

根據(jù)3M-4-TMAB和4-TMAP代謝物的結(jié)構(gòu)特征，合成每種標(biāo)準(zhǔn)物，并通過MSI定量SPF腦中的內(nèi)源性濃度。通過NMR確定3M-4-TMAB和4-TMAP在細菌樣品中以等摩爾水平存在（圖3）；因此，將3M-4-TMAB和4-TMAP的標(biāo)準(zhǔn)品均勻混合，并在MSI分析之前通過在GF腦中標(biāo)出確定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品來生成標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線。這被用來確定SPF腦中內(nèi)源性代謝物的濃度。整個大腦中代謝產(chǎn)物的平均濃度確定為0.37至0.4 μM。胼胝體和海馬體的平均濃度較高，約為13至17.1 μM，表明在這些區(qū)域中3M-4-TMAB / 4-TMAP顯著積累（圖5）。

圖5對小鼠大腦中的3M-4-TMAB和4-TMAP進行定量（A）制備3M-4-TMAB和4-TMAP標(biāo)準(zhǔn)品的等摩爾混合物，并以各種濃度將其點樣在GF腦切片上；（B）來自MSI結(jié)果的每個點的m / z 160.133離子強度用于生成相對于每個點中標(biāo)準(zhǔn)量的濃度曲線；（C）濃度曲線用于計算整個大腦，高豐度區(qū)域，胼胝體和海馬區(qū)中3M-4-TMAB和4-TMAP的平均內(nèi)源濃度。

6. 3M-4-TMAB和4-TMAP抑制宿主細胞中的肉堿功能

考慮到細菌代謝產(chǎn)物3M-4-TMAB和4-TMAP與宿主肉堿之間觀察到的結(jié)構(gòu)相似性和空間共定位水平，我們假設(shè)這些細菌代謝物分子可能抑制宿主細胞中的肉堿功能。我們使用合成的3M-4-TMAB和4-TMAP在XF棕櫚酸-牛血清白蛋白(BSA) FAO底物測定方法，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）白質(zhì)鼠細胞培養(yǎng)模型中測試了它們在肉堿存在下抑制線粒體功能的能力。該測定法以耗氧率（OCR）作為讀數(shù)來測量FAO，因此使我們能夠評估一種分子是否能夠抑制FAO。在0.5 mM肉堿和3M-4-TMAB和4-TMAP分別存在或以2 mM聯(lián)合存在的條件下，將小鼠脊髓衍生的細胞體外培養(yǎng)8天，持續(xù)24小時。僅單獨使用3M-4-TMAB（在四個生物學(xué)重復(fù)中減少了12％），通過4-TMAP（減少了14％）或通過等摩爾的3M-4-TMAB / 4-TMAP混合物（17％）對FAO進行了顯著抑制 減少（圖6）。 所見的抑制作用與埃托莫西的抑制作用相當(dāng)（減少25％），后者是FAO的不可逆抑制劑。此外，在不向肉毒堿和培養(yǎng)基中添加肉堿的情況下，以20 μM的組合測試3M-4-TMAB和4-TMAP，表明在鼠腦中3M-4-TMAB和4-TMAP的濃度與發(fā)現(xiàn)的濃度相似，可能顯著減少白質(zhì)細胞中的FAO。

圖6.在存在3M-4-TMAB和4-TMAP的情況下，OCR被用作FAO的指標(biāo)。在肉堿和所示濃度的3M-4-TMAB，4-TMAP或3M-4-TMAB和4-TMAP的組合存在下，在原代鼠科髓鞘型CNS白質(zhì)培養(yǎng)物中，棕櫚酸酯的氧化顯著降低。依托莫西非，FAO的不可逆抑制劑被用作對照。每個符號代表一個實驗的相對平均值（n = 4）。通過合并來自一只懷孕雌性小鼠的所有胚胎的游離脊髓細胞，獲得了用于生成CNS白質(zhì)模型的神經(jīng)前體。

在這里，多學(xué)科交叉方法和新穎的質(zhì)譜成像技術(shù)的應(yīng)用使得能夠闡明分子模擬作為跨MGB軸的另一種通信方式。微生物與線粒體的相互干擾可能是腸道微生物組與宿主之間交流的重要手段，在線粒體功能障礙和腸道微生物組是重要因素的疾病中，其生物學(xué)重要性可能未被充分認識。