題目：Cellular heterogeneity and immune microenvironment revealed by single-cell transcriptome in venous malformation and cavernous venous malformation
日期：2022-01
期刊：Journal of Molecular and Cellular Cardiology
鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022282821001760
血管異常（vascular anomalies，VA）可分為血管腫瘤和血管畸形兩大類。靜脈畸形（VM）和海綿體靜脈畸形（CVM）是發(fā)生在眼眶的血管畸形的兩種主要類型。
在臨床上真正不可擴(kuò)張的 VM 非常罕見，具有可擴(kuò)張海綿狀 VM 的患者在CT 血管造影(CTA) 中的外觀與 CVM 非常相似，這種相似性對VM和CVM的正確診斷帶來了困難，需要深入研究它們的細(xì)胞組成。因此，關(guān)于這兩種疾病的細(xì)胞組成、細(xì)胞增殖特性、免疫細(xì)胞（類型/比例）等問題急需了解。
本文在單細(xì)胞水平上證明了兩種疾病的異質(zhì)性，揭示了炎癥相關(guān)通路和雌激素反應(yīng)通路是 VM 進(jìn)展中更重要的通路，并確定了其中的許多免疫細(xì)胞亞型。
作者拿到了三個(gè) CVM 樣本和兩個(gè) VM 樣本，即 CVM_1、CVM_2、CVM_3、VM_1 和 VM_2，質(zhì)控過濾后得到了35,245 個(gè)細(xì)胞。降維聚類得到了24個(gè)clusters，注釋得到11種細(xì)胞類型：內(nèi)皮細(xì)胞（c5、6、14）、平滑肌細(xì)胞（c0、2、4、20、22）、成纖維細(xì)胞（c1、8、12）、周細(xì)胞（c23）、嗜中性粒細(xì)胞（c11）、 T 細(xì)胞/自然殺傷細(xì)胞（c7、16）、B 細(xì)胞（c9、17）、巨噬細(xì)胞（c3、13、15、19）、少突膠質(zhì)細(xì)胞（c10）、增殖細(xì)胞（c21）和星形膠質(zhì)細(xì)胞（ c18)。
之后比較了來自不同樣本的細(xì)胞類型比例：所有細(xì)胞類型均包含了 5 個(gè)樣本的細(xì)胞，除了星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞這兩種小細(xì)胞類型（分別包含 178 個(gè)細(xì)胞和 51 個(gè)細(xì)胞）。
CVM 和 VM 在樣本之間的細(xì)胞組成差異很大，CVM 中的 平滑肌細(xì)胞較多，VM 中的巨噬細(xì)胞較多。
5579 個(gè) 內(nèi)皮細(xì)胞繼續(xù)細(xì)分得到了10個(gè)clusters，注釋到了4種細(xì)胞類型：動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(c0, 5, using HEY1 as a marker), 靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (c1, 2, 4, 6, 7, using NR2F2 as a marker), 毛細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞 (c3, 8, using RGCC as a marker) and 增殖內(nèi)皮細(xì)胞 (c9, using MKI67 as a marker)
動(dòng)脈 ECs 在 CVM 和 VM 樣本中的比例分別為 50.44% 和 7.98%，靜脈 ECs 的比例為 37.19% 和 68.99%，而毛細(xì)血管 ECs 的比例為 11.88% 和 21.63%。這表明 VM 有更多的靜脈成分，而 CVM 有更多的動(dòng)脈成分，表明不同的疾病起源。
對hallmark gene sets進(jìn)行GSVA分析發(fā)現(xiàn)，相比于CVM，VM 中發(fā)現(xiàn)了由 NF-κB、IL6/JAK/STAT3 信號介導(dǎo)的TNFα信號通路，以及雌激素反應(yīng)通路；而在CVM 中觀察到幾種明顯上調(diào)的代謝相關(guān)途徑，如氧化磷酸化、糖酵解和脂肪酸代謝
進(jìn)一步的 IF 染色顯示 VM 組織中 IL6、雌激素受體 (ER) 和 KLF10 的表達(dá)水平增強(qiáng)，證實(shí)了 VM 發(fā)展過程中 IL6/JAK/STAT3 信號和雌激素反應(yīng)早期通路的上調(diào)。這些結(jié)果表明，早期雌激素反應(yīng)和先天免疫反應(yīng)可能與 VM 的發(fā)展密切相關(guān)。
11,850 個(gè) SMC繼續(xù)細(xì)分為 12 個(gè)clusters，注釋到3種細(xì)胞類型：血管 SMC(VSMCs, c0, 2, 4, 5, 6, using MYH11 as a marker), TM1 fibroblast-like cells (c1, 3, 7, using DCN as a marker) and other cells
進(jìn)一步分析了 CVM 和 VM 樣本中 5 個(gè) VSMC 集群的比例。c0 在 CVM 和 VM 樣本之間的比例分別為 37.91% 和 19.99%，c2 的比例為 22.27% 和 38.07%，而c4 的比例為 15.35% 和 24.22%。與 VM 相比，CVM 中的動(dòng)脈 VSMC 占比更高，這個(gè)和之前的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)果類似。
GSVA分析發(fā)現(xiàn)NF-κB and IL6/JAK/STAT3信號介導(dǎo)的TNFα信號通路增強(qiáng)，同時(shí)在 CVM 中發(fā)現(xiàn)了明顯的肌細(xì)胞生成通路。
進(jìn)一步的 IF 染色顯示 CVM 組織中 α-SMA、MYH11 和HDAC1的表達(dá)水平增強(qiáng)，證實(shí)了 CVM 中上調(diào)的肌細(xì)胞生成通路。相反，NF-κB介導(dǎo) 的 TNFα 信號途徑的關(guān)鍵標(biāo)志物 NR4A1 在 VM 組織中大量表達(dá)。另外，SMC 中先天免疫反應(yīng)與 VM 進(jìn)展的關(guān)系和 EC 中發(fā)現(xiàn)的一致。
作者使用Monocle 2 對內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞和 血管平滑肌細(xì)胞之間的發(fā)育軌跡進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了總共 5 個(gè)狀態(tài)，分為兩個(gè)主要分支。
從左下角的分支開始，然后細(xì)胞一部分向上（血管壁細(xì)胞-成纖維細(xì)胞、SMC、周細(xì)胞）和向右（EC）發(fā)育。成熟的內(nèi)皮細(xì)胞（狀態(tài) 4）和血管壁細(xì)胞（狀態(tài) 1）位于軌跡的末端，而一小部分 SMC 可能充當(dāng)類似干細(xì)胞的角色（狀態(tài) 2、3、5）。
軌跡發(fā)育中的基因變化主要有3種模式：內(nèi)皮細(xì)胞的marker基因SEMA3G和TIE1來自模塊 1，并沿?cái)M時(shí)序軌跡上調(diào)，在軌跡左側(cè)達(dá)到峰值。在模塊 2 中是成熟血管壁細(xì)胞的marker基因，如DCN和COL11A1，在軌跡右側(cè)達(dá)到峰值。
模塊1中的基因，主要是內(nèi)皮細(xì)胞分化通路，例如ECM 結(jié)構(gòu)成分、ECM 結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合和整合素結(jié)合；模塊1中的基因，主要是血管壁細(xì)胞分化，例如MHC II 類蛋白結(jié)合、syntaxin-3 結(jié)合和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子結(jié)合。
另外還發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)基因與 EC 分化（ PIK3C2A、 CD74、 SYNE2) 和血管壁細(xì)胞分化 ( MRC2、VCAN、SNAI2 ) 有關(guān)，這些基因分別是向內(nèi)皮分支和間充質(zhì)分支分化的關(guān)鍵基因。
總共有將近 30% 的細(xì)胞被確定為免疫細(xì)胞，作者假設(shè) EC 和血管壁細(xì)胞的可塑性可能是免疫微環(huán)境 (IME) 的信號驅(qū)動(dòng)。將9740 個(gè)免疫細(xì)胞細(xì)分為 15 個(gè)clusters，然后注釋了5種細(xì)胞類型。
分析CVM 和 VM 樣本中 5 種主要免疫細(xì)胞類型的比例發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞在 CVM 和 VM 樣本中的比例分別為 48.67% 和 67.40%，而 T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞的比例分別為 31.50% 和 20.25%。
GSVA發(fā)現(xiàn)，與 CVM 相比，VM中巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的血管生成通路顯著上調(diào)，另外發(fā)現(xiàn) NK 細(xì)胞和 T 細(xì)胞富集了 NF-κB 介導(dǎo)的 TNFα 信號傳導(dǎo)途徑。在 CVM中， 巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞以及 NK 細(xì)胞和 T 細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了上調(diào)的肌細(xì)胞生成途徑。
作者使用 CellPhoneDB 分析了所以細(xì)胞類型的配體-受體相互作用。在所有細(xì)胞類型中，周細(xì)胞表現(xiàn)出與 EC 和成纖維細(xì)胞的強(qiáng)烈相互作用。EC 顯示出與成纖維細(xì)胞的強(qiáng)烈相互作用。巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出與周細(xì)胞、EC 和成纖維細(xì)胞的中度相互作用。
之后分析了巨噬細(xì)胞（圖B）、中性粒細(xì)胞（圖C）和其他細(xì)胞類型之間的特定配體-受體對。發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的IL6與EC 和周細(xì)胞上的IL6受體緊密結(jié)合。巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞上的VEGFA與 EC 上的FLT1和KDR密切結(jié)合。巨噬細(xì)胞上的CXCL8、CXCL1、CCL2與 EC 上的ACKR1之間密切結(jié)合。NOTCH1/2-JAG2/DLL4對在巨噬細(xì)胞和 EC 之間也有很高的相互作用分?jǐn)?shù)。
作者在單細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)了 CVM 和 VM 中細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征，并分析了它們向內(nèi)皮細(xì)胞和血管壁細(xì)胞的分化、關(guān)鍵信號通路和免疫細(xì)胞的作用來確定它們在疾病發(fā)展中的作用。在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和免疫細(xì)胞中觀察到顯著的異質(zhì)性。此外，在巨噬細(xì)胞和 內(nèi)皮細(xì)胞之間觀察到了豐富的配體-受體相互作用，并且發(fā)現(xiàn)先天免疫反應(yīng)相關(guān)信號與 VM 進(jìn)展密切相關(guān)。
